RAPD技术在昆虫学中的应用

随机扩增多态DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,简称RAPD)是J.Williams和J.Welsh两个研究小组于1990年同时提出的一种随机引物扩增,寻找多态DNA片段的遗传标记技术,它是建立在PCR技术基础上,以随机的寡聚脱氧核苷酸作为PCR反应引物,对基因DNA进行扩增而显示DNA图谱和对物种进行亲缘关系、系统发育分子水平的鉴别,以及分子生物学、分子生态学的研究。RAPD标记的一个明显的特点是RAPD引物无特异性,可以用未知序列的基因组DNA作为模板,通过PCR扩增获得一组不连续的DNA片段,且RAPD所需引物较短,10个左右的寡核苷酸即可…     

RAPD标记技术及其在畜禽遗传育种中的应用

RAPD标记技术是1990年由Williams和welsh领导的两个实验室独立发展起来的一项DNA多态性检测技术[1,2].它是利用一系列碱基顺序随机排列的寡聚核苷酸作为引物,对目的基因组DNA进行扩增.这种特定的随机引物与作为模板的基因组DNA上特定的位点结合,当这些结合位点在模板DNA上的分布符合RAPD扩增反应条件,即在一定范围内模板DNA上有与引物互补的反向重复序列时,就可以扩增出该范围内的DNA片段.不同物种基因组DNA中这种反向重复序列的数目和间隔距离的长短不同,通过扩增产物的比较,可以识别出这些物种中基因组DNA的多态性片段.     

珍稀濒危植物香果树RAPD反应条件的优化

以采自湖北省神农架地区的14株香果树Emmenopterys henryi为材料,提取其叶片基因组DNA,并以其基因组DNA为模板进行随机扩增多态性DNA(RAPD)反应条件的优化。RAPD反应条件中的各个因子,包括模板DNA质量浓度、引物浓度、dNTP浓度、DNA聚合酶浓度和Mg2 浓度。结果表明,香果树基因组DNA在以下条件有较好的扩增效果:25μL体系中,Taq酶1.33×10-3kat.L-1;随机引物0.5μmol.L-1;Mg2 2.6 mmol.L-1;dNTP 220μmol.L-1;DNA模板4.40 mg.L-1。聚合酶链式反应(PCR)程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,43℃退火1 min,72℃延伸2 min,经过40个循环,最后72℃延伸8 min。此体系和反应程序可获得比较稳定的扩增结果。图6表1参8     

秦岭野生蕙兰RAPD反应体系的优化

【目的】建立适宜于秦岭野生蕙兰RAPD分析的PCR反应条件,为利用RAPD技术研究秦岭野生蕙兰的遗传多样性提供技术依据。【方法】以秦岭野生蕙兰叶片为材料,采用改良CTAB法,提取野生蕙兰基因组DNA进行RAPD扩增反应。以5′-CCTTGACGCA-3′(S12)为随机引物,通过L16(45)正交试验与单因素试验2种方法,对RAPD反应体系的主要参数(Mg2+浓度、dNTPs浓度、模板DNA用量、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量)进行摸索和优化,并经过验证试验,建立适合秦岭野生蕙兰的RAPD遗传多样性分析体系。【结果】研究得到的适于秦岭野生蕙兰的RAPD遗传多样性分析体系为:25μL反应体系中,Mg2+浓度为2.5μmol/L,dNTPs浓度为0.16mmol/L,模板DNA用量为100ng,引物浓度0.6μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.5U。各因素对RAPD反应的影响程度依次为:模板DNA用量>引物浓度>Taq DNA聚合酶用量>dNTPs浓度>Mg2+浓度。【结论】优化的秦岭野生蕙兰RAPD反应体系扩增效果比较理想,扩增条带的多态性明显、清晰度高、重复性好,可用于进一步的遗传多样性分析。     

RAPD法鉴定紫花苜蓿品种的条件优化

以阿尔冈金等6个地方主栽的紫花苜蓿品种为材料,对随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphic DNA,RAPD)法鉴定不同紫花苜蓿品种的试验条件进行了优化。结果表明,使用改良的CTAB法提取紫花苜蓿基因组DNA蛋白较少,质量较高;PCR扩增反应体系中使用1 U/μL的TaqDNA聚合酶、10 ng/μL的DNA模板和300μmol/L的dNTP,扩增的条带较多,且较清晰,适宜于后续RAPD法鉴定;从100条10个碱基的随机引物中筛选出S37与S140两条引物,适用于6个不同苜蓿品种的鉴定。     

甘蓝型油菜"79.7"细胞核雄性不育基因RAPD分子标记初步研究

对油菜DNA的RAPD扩增中Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶和模板DNA用量、不同PCR扩增仪以及用不同方法制备的DNA对扩增结果的影响进行了探讨.在确立了本研究的RAPD反应体系后,对油菜"79.7"细胞核雄性不育及其保持系的育性相关基因进行了分子标记.从使用的254个随机引物中,发现随机引物2-70-11和60-37可分别检测到一个与可育基因连锁的RAPD分子标记2-70-11700和60-371150.     

番茄品种渝粉109的DNA指纹图谱构建

用SDS法提取番茄杂一代品种"渝粉109"及其亲本的基因组DNA,通过RAPD-PCR分子标记方法,构建其DNA指纹图谱,用于种子纯度鉴定。利用200个RAPD随机引物,以杂一代品种及其亲本的基因组DNA为模板组进行筛选,结果显示:8个RAPD引物的DNA条带表现出多态性,其中R3能稳定地在亲本之间扩增出互补的特异条带。经定向验证、种子真伪鉴定、纯度鉴定,表明构建的渝粉109指纹图谱有效。     

大白菜RAPD反应条件的优化

RAPD是作物主要农艺性状分子标记及遗传多样性研究的一项重要技术。为了适应大白菜反应体系,本试验以大白菜品种413、96及其F1为试材,对影响RAPD扩增的模板DNA用量、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、引物浓度等因素进行了优化,结果如下:20μl PCR反应体系,30 ng(1.5μl)DNA模板,3 mmol/L Mg2+,0.01 U/μl Taq DNA聚合酶,0.4 mmol/L dNTPs,0.8μmol/L引物为最佳反应浓度。     

芫荽RAPD体系优化

以芜萎基因组DNA为模板,对RAPD扩增反应条件进行优化,以期建立适合芜荽的RAPD的最优反应体系,结果表明:PCR扩增体系(总体积20μL)为:模板DNA1.0 ng·μL-1,dNTP 0.45 mmol·L-1,随机引物1.3μmol·L-1,Taq酶0.6 U,Mg2+2.0 mmol·L-1,退火温度39℃,...     

ISSR标记技术及其在果树遗传育种中的应用

简单重复序列间扩增(ISSR)是在简单重复序列(SSR)基础上发展起来的一种新技术.该技术以锚定的微卫星DNA为引物,对与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片断进行PCR扩增.ISSR标记具有较长的引物序列,退火温度高.表现出较好的稳定性,且结合位点丰富,可以检测到基因组中多个位点的差异,能够揭示出比限制性片段长度多态性(RFLP)、随机引物扩增多态DNA(RAPD)、SSR更多的多态性信息.对ISSR标记技术的原理、特点及其在果树种质鉴定、遗传多样性、居群遗传结构、进化与亲缘关系分析以及分子辅助育种等研究方面的应用进行了综述.     

西瓜枯萎病菌最优RAPD体系的建立

采用完全随机试验,对适合西瓜枯萎病菌的最优RAPD体系(包括随机引物浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度以及扩增反应中的退火温度)进行了探索,寻求各因素间的最优组合,最终得到了条带清晰的最优RAPD体系。反应体积为25μL,其中随机引物浓度为10μmol／L,Taq DNA聚合酶为1．25U,模板DNA度为1．6md/L,dNTPs浓度为2mmol／μL,扩增反应的退火温度为37℃。     

松材线虫RAPD-PCR反应体系的优化与分子鉴定标记的筛选

应用随机引物S344、S356和S360比较分析了PCR热循环复性温度、Mg2+浓度和模板浓度对松材线虫基因组DNA的RAPD扩增结果的影响,旨在建立松材线虫的最佳反应体系,并以此进行松材线虫的分子鉴定标记筛选。结果表明:37℃的复性温度、3.0 mmol.L-1Mg2+、10μL反应体系中松材线虫基因组DNA模板1~25 ng是研究松材线虫RAPD特征的最佳反应体系。利用此反应体系,通过对100个随机引物的分析,获得了3条松材线虫区别于拟松材线虫的分子鉴定标记。     

甘薯RAPD-PCR反应条件的优化

以徐薯22的基因组DNA作为PCR反应模板,以随机引物进行RAPD-PCR反应,通过设置ToqDNA聚合酶加量、MgCl2 浓度、dNTPs 浓度、模板DNA加量、引物加量的不同梯度,探索出一套适合甘薯RAPD-PCR的最优反应条件.试验结果表明,最优反应条件为反应体系25.0μL,2.5μL的PCR 10xBuffer、0.15U 的Taq DNA 聚合酶、3.0 nmol·μL-1的MgCl2、0.6 nmol·μL-1的dNTPs、40 ng的DNA模板、40 ng的RAPD引物.     

樟科16个树种木材的RAPD与ISSR分子鉴别

采用随机扩增多态性(RAPD)和简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)技术鉴别樟科Lauraceae16个树种。用改良十六烷基三甲基溴化铵-十二烷基硫酸钠(CTAB-SDS)法提取樟科16个树种192株(12株·种-1)木质部基因组DNA,用RAPD与ISSR技术对它们进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。共筛选出8条RAPD引物与6条ISSR引物,8条RAPD引物共扩增出165条大小为100~2 000 bp的条带,其中多态性条带为153条,多态率为92.7%;6条ISSR引物共扩增出96条大小为100~2 000 bp的条带,其中多态性条带为86条,多态率为89.6%。通过1~2个引物扩增的多态性条带就可鉴别与区分参试的16个树种,为树种鉴定提供技术支持。     

女贞不同种质材料基因组 DNA 的提取及 RAPD 引物筛选

[目的]提取女贞不同种质材料的基因组DNA,并筛选RAPD引物。[方法]采用改良CTAB法提取女贞基因组DNA,并以此种方法提取的女贞基因组DNA为模板,对RAPD引物进行PCR扩增,筛选有效引物。[结果]筛选出21个多态性丰富、条带清晰且重复性好的有效引物,经检测所获得的基因组DNA条带清晰,且OD260／DD280在1．8左右。用筛选出的21个有效引物对126份女贞种质材料进行RAPD—PCR扩增,均可获得带型丰富且清晰可辨的DNA指纹图谱。[结论]该方法为快速和准确地应用RAPD方法分析女贞种质材料的遗传多样性提供了依据。     

松材线虫RAPD规范化反应体系的构建

 针对随机扩增DNA多态性(RAPD)低重复性的特点,在研究松材线虫遗传多样性的过程中,对可能影响RAPD扩增结果的PCR仪型号,模板DNA,Mg²⁺,TaqDNA聚合酶引物及dNTP浓度等因素进行了实验探索,以获得最佳反应条件,构建稳定的松材线虫RAPD扩增反应体系,结果发现上述影响因子在相当大的范围内对RAPD扩增结果的影响有限,进而对在不同实验室间的RAPD结果缺乏重复性和可比性的原因进行了讨论,认为模板DNA的污染是造成这一现象的重要原因,并在此基础上提出了相应的规范化操作建议.     

濒危竹种小蓬竹（Drepanostachyum luodianense） RAPD PCR反应体系优化

为了建立小蓬竹（Drepanostachyum luodianense） RAPD PCR反应的最优体系,以小蓬竹基因组DNA为模板,对影响其RAPD扩增的dNTPs浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度、Mg2+浓度等重要参数进行了单因子和正交试验。试验得出小蓬竹RAPD最优反应体系为: 20 μL反应体系,10×PCR buffer为1/10体积,dNTPs为100 μmol·L-1,模板DNA量为30 ng,Taq DNA聚合酶为10 U,引物浓度为02 μmol·L-1,Mg2+浓度为15 mmol·L-1。优化后的RAPD PCR反应程序为: 94℃预变性5 min,然后进入35个循环,即94℃变性1 min,35℃退火30 s,72℃延伸90 s,循环完毕后于72℃延伸7 min,最后在4℃保持。     

鲫鱼基因组DNA的扩增及在SSR分析中的验证

【目的】优化鲫鱼全基因组DNA扩增方法。【方法】使用内切酶酶切初孵仔鱼的基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头,根据酶切位点序列与接头序列设计引物,采用PCR法扩增酶切片段,增加基因组DNA的数量。【结果】使用Taq I内切酶酶切鲫鱼基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头后PCR扩增,获得扩增产物集中于250～1 500 bp。以扩增的滇池高背鲫鱼基因组DNA为模板,PCR扩增滇池高背鲫鱼的微卫星分子标记(SSR)位点,获得预期的扩增片段,电泳图谱与对照组(未扩增的基因组DNA为PCR模板)无差异。【结论】本研究优化了鲫鱼基因组DNA的扩增方法,并可用于SSR分析中,为鱼类大规模遗传分析提供了技术支撑。     

大樱桃基因组DNA提取及RAPD分析

以大樱桃8个品种为研究对象,利用改进CTAB法进行DNA提取,使用10碱基随机引物,通过PCR进行RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)扩增,建立了鉴定大樱桃品种的分子鉴定图谱。结果表明:较高质量的DNA和理想的RAPD反应体系能够保证RAPD技术具有较好的稳定性;筛选出的不同引物的RAPD扩增谱带组合可用于大樱桃栽培品种的分子鉴定,具有在生产应用的潜在性。     

蛇莓RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

采用单因素试验结合正交试验,对PCR反应体系中的5种主要反应因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度进行优化筛选,确立了适合蛇莓基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系,RAPD反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2μmol/L、DNA模板60 ng;ISSR反应体系(20μL):Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1μmol/L、DNA模板60 ng。利用确立的体系对24份蛇莓种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好。