草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建

A plasmid containing target DNA and a standard curve for real-time quantitative PCR of the cold-induced Cor3 gene of Volvariella volvacea were constructed. These will provide the basis for further research on Cor3 gene expression at low temperature, and ultimately for assigning a role for the gene in the low temperature autolysis of V. volvacea.     

编码S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的草菇冷诱导基因Cor3功能验证

将草菇(Volvariella volvacea)冷诱导基因Cor3cDNA序列经EcoR I酶切克隆到原核表达载体pPROK-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达、分离纯化发现该蛋白的分子量约为43kD,等电聚焦电泳结果表明,该蛋白的等电点为6.1,HPLC检测说明合成方向的酶活性为每毫克蛋白每分钟4.5μmol,DNTB与同型半胱氨酸颜色反应测定水解方向的酶活性为每毫克蛋白每分钟0.7μmol,根据上述特性可以确定草菇冷诱导基因Cor3所编码的蛋白是S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)。     

应用cDNA-AFLP技术分离草菇冷诱导表达基因

 采用cDNA-AFLP技术筛选获得了5个草菇冷诱导表达基因片段VC1、VC2、VC3、VC4 和VC5。测序结果表明, 5个DNA片段大小分别为247 bp、219 bp、172 bp、350 bp和171 bp。同源性BLAST搜索结果显示, VC1、VC2、VC3、VC4和VC5片段目前都没有同源的核酸序列; VC1片段翻译的蛋白质序列与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa) 的假拟蛋白具有一定的同源性, VC2片段翻译的蛋白质序列与水稻的AMP脱氨酶具有一定的同源性, VC3片段翻译的蛋白质序列与Danio rerio的糖原合酶激酶3α具有较高的同源性, VC4片段翻译的蛋白质序列与Leuconostocm esenteroides的假拟蛋白有一定的同源性, VC5片段翻译的蛋白质序列没有搜索到同源序列。     

草菇ras启动子区域的克隆及其序列分析

根据Kajiwara S等报道的ras启动子的序列设计并合成一对特异引物，以草菇菌丝的总DNA为模板，通过PCR扩增，获得一条长约0．75kb片段。DNA序列测定结果表明，该片段长度为751bp。采用Blast软件和Promoter predictions软件进行启动子序列结构分析，结果表明，该片段中243-293bp和539-589bp两区域为ras启动子的基础启动子区。在283bp和579bp处有两个转录起始位点，在244～247bp和292～295bp之间有2个TATAbox，在36～39bp、377～380bp、434-437bp和716～719bp之间有4个CAATbox。此外，该片段中还含有9个Gbox、12个Ibox、2个Pbox以及3个重要顺式作用元件：ABRE元件、WUN-motif(基元)和HSE元件。     

草菇丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因的克隆及序列分析

根据担子菌丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因编码的氨基酸序列设计两对简并引物,通过巢式简并PCR方法获得草菇(Volvariella volvacea)丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因(vv-stpk1)的保守片段,然后通过基因组步行的方法获得了vv-stpk1全长序列。vv-stpk1全长为2 003 bp,含有8个内含子,长度分别为72、57、53、54、45、50、55和48 bp,可编码522个氨基酸残基的多肽。推定的氨基酸序列与玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、木糖发酵酵母(Pichia stipitis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)中与细胞形态发生相关的丝/苏氨酸蛋白激酶Orb6的相似性分别为81%、77%和76%,对VV-STPK1蛋白的系统发生学分析的结果表明,VV-STPK1与Orb6同源蛋白聚在同一进化枝上,这些数据都支持VV-STPK1蛋白为与细胞形态发生相关同源蛋白的推定。     

低温对草菇菌株碳氮利用能力的影响

分别将供试草菇菌株在 - 18℃ (± 1℃ )和 4℃ (± 1℃ )下进行低温处理 ,并在 2 5℃下将经低温处理菌株对 6种碳源和 6种氮源的利用能力与对照比较。结果表明 ,不同草菇菌株对低温的耐受能力存在明显差异 ,低温使草菇菌丝复活时间延长、生长势减弱、生长速度减慢或丧失对部分氮源的利用能力。但邓庄V2 3 、DwV 1和白草菇等菌株经低温处理后 ,在部分培养基上的菌丝生长速度快于对照     

斑玉蕈甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆与序列分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是糖酵解和卡尔文循环中的关键酶,本实验室之前的研究发现斑玉蕈菌丝的GAPDH表达随培养基中葡萄糖添加浓度的变化而变化,在此基础上我们首次克隆了斑玉蕈GAPDH的DNA和cDNA序列,结果斑玉蕈gpd基因长2 724 bp,对比基因组DNA和cDNA序列知其中有7个内含子、8个外显子;其理论分子量为36.15 kD、编码蛋白质含338个氨基酸、等电点(PI)为8.24。     

黄伞菌株中三磷酸甘油醛脱氢酶基因片段的分离鉴定与保守性验证

本研究以黄伞菌丝cDNA为模板，设计简并引物，经PCR扩增出两条片段SLI和S12，经过回收、重扩增、克隆与鉴定后进行测序分析，结果发现SI．1的序列在Genebank中与三磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-Dhosphate dehydrogease，GPD）基因的同源性达到85％，根据SLI序列设计引物，以黄伞菌丝体、原基、菇蕾、子实体菌柄、子实体菌盖的cDNA为模板进行PCR反应以验证其保守性，结果显示此片段在不同分化发育阶段表达量相同。