条锈菌诱导上调表达的小麦腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）基因的克隆及其特征分析

为了克隆条锈菌诱导上调表达的小麦腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）基因并研究其在小麦感病、抗病单株苗期抗条锈病防御反应中的作用,以大麦（Hordeum vulgareL.）SAMDC全长cDNA序列为信息探针,采用电子克隆、RACE（Rapid amplification of cDNA ends）和RT-PCR方法,从条锈菌（Puccinia stri-iformisf.sp.tritici）CYR32侵染的小麦（Triticum aestivumL.）抗条锈病新种质NR1121中分离出1个新的小麦SAMDC基因家族成员,命名为TaSAMDC2（GU016570）。TaSAMDC2基因cDNA序列全长2 003 bp,5′非翻译区区域和一个带有Poly（A）的3′非翻译区区域长分别为553和283 bp;该基因的开放阅读框为1 167 bp,编码388个氨基酸,编码的氨基酸序列包含酶原剪切位点和PEST结构域。基因组序列全长2 539bp,位于5′UTR存在一个526 bp长的内含子序列,内含子的剪切位点均符合真核生物GT-AG规则。同源序列分析表明,TaSAMDC2与来自大麦、水稻（Oryza sativaL.）、玉米（Zea maysL.）、一粒小麦（TriticummonococcumL.）4种植物SAMDC蛋白的相似性分别为95.0%、85.0%、80.0%和80.0%。半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR分析表明,TaSAMDC2的表达受条锈菌诱导,小麦苗期经条锈菌侵染后,在抗病材料中,该基因于48 hpi上调表达至最高水平,而在感病材料中先下调、上调表达至最高水平明显滞后。结果提示,分离到的是一个条锈菌CYR32诱导后上调表达的小麦SAMDC基因,该基因可能参与了小麦的抗条锈病反应。     

小麦TaPK7基因的克隆及其在多种胁迫条件下的表达分析

为了揭示小麦TaPK7基因对不同逆境胁迫的应答机制, 以SAPK7基因的全长cDNA序列为信息探针,采用电子克隆和RT-PCR的方法,从抗旱小麦品种旱选10号中克隆到一个包含1 074 bp开放阅读框、编码357个氨基酸的cDNA序列,命名为TaPK7.生物信息学分析表明,TaPK7同时具有磷酸化丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸的活性.氨基酸序列比对发现,TaPK7与水稻、玉米、大麦等植物中受逆境胁迫诱导表达的直系同源基因高度同源.实时定量RT-PCR检测结果表明,TaPK7参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫和ABA处理的应答反应,但在不同胁迫或处理下的表达模式不同,TaPK7对四种非生物胁迫的敏感性次序为:高盐＞高渗＞低温＞ABA.     

麝香百合液泡膜水孔蛋白基因LlTIP2的克隆及生物信息学分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白,属于膜主要内在蛋白(major intrinsic proteins,MIP)超家族.采用RT-PCR和RACE法从麝香百合(Lilium longiflorum)叶片克隆得到1个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)基因的全长cDNA序列,命名为LTIP2(GenBank登录号:JN085950).该基因cDNA全长986 bp,包括208bp的3’-非翻译区,744 bp开放阅读框以及34 bp的5’-非翻译区,共编码247个氨基酸.由L1TI P2推导的氨基酸序列具有2个高度保守的水孔蛋白NPA (Asn-Pro-Ala)基序以及MIP的特征序列SGGHVNPAVTFG.同源性分析表明,LITIP2氨基酸序列与陆地棉(Gossypium hirsutum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦草(Lolium perenne)和小麦(Triticum aestivum)等植物TIP2的同源性分别达77％、74％、73％和72％.系统进化树分析表明LlTIP2属于液泡膜水孔蛋白TIP2亚类新成员.     

小麦16.9 kD热激蛋白cDNA克隆及其表达分析

为进一步了解小分子量热激蛋白在小麦耐热能力中的作用,根据玉米16.9 kD小分子热激蛋白的氨基酸序列,采用同源序列法进行序列拼接和引物设计,用RT-PCR扩增获得了1个源自小麦叶片的热激蛋白基因cDNA片段,即TaHSP16.9-1(GenBank登录号为EU649679).TaHSP16.9-1全长770 bp,5′非翻译区81 bp,3′非翻译区233 bp,开放阅读框编码151个氨基酸.序列分析结果表明,此蛋白与已知单子叶植物来源的同类基因高度同源,相似性介于78.3%～96.7%之间.定量RT-PCR表达谱分析显示,TaHSP16.9-1在小麦抽穗期的茎和旗叶以及幼苗期叶片中均能表达,其在小麦幼苗叶片中的表达受高温胁迫的诱导.     

小麦CO-like基因TaCO9的克隆及分析

CO蛋白(CONSTANS)是光周期途径中重要的调控因子,为了从普通小麦中进一步挖掘COlike基因,利用同源克隆的方法得到与大麦HvCO9基因同源的小麦TaCO9基因。结果表明,在冬性品种西农889中,初步克隆得到TaCO9基因的三个同源序列,分别命名为TaCO9-1、TaCO9-2、TaCO9-3。其cDNA序列全长均为870bp,开放阅读框为1 977bp,编码289个氨基酸,含有CO-like蛋白家族典型的CCT结构域,但不含B-box结构域;而在春性品种中发现TaCO9-1序列的第二外显子区域有6个碱基的插入,利用中国春缺-四体材料将该序列定位于小麦的1A染色体,命名为TaCO9-1A。系统发育分析表明,TaCO9蛋白与水稻Ghd7及大麦HvCO9位于同一分支。空间结构分析表明,其CCT结构域的NF-YA2区域较为保守,而该区域与CCAAT box互作相关。本研究克隆得到的TaCO9基因可能是小麦CO-like基因家族的新成员,与大麦HvCO9基因的结构相似,可作为新的小麦光周期候选基因加以研究利用。     

香蕉NBS-LRR抗病基因类似序列的克隆和分析

根据大多数抗病基因的核苷酸结合区(NBS)和富含亮氨酸重复序列(LRR)保守区的氨基酸序列设计PCR简并引物,利用快速而又可行的简并PCR技术获得NBS-LRR类抗病基因类似序列。笔者利用该技术从香蕉cDNA中获得了一个NBS-LRR类抗病基因类似序列,命名为B-NB(SAY739270)。结构域分析发现,B-NBS含有NBS蛋白所具有的P-Loop、Kinase-2、Kinase-3a和下游疏水GLPLAL结构域(HD,GLPLAL)4个保守基序。聚类分析发现,B-NBS与已报道的6个植物抗病基因的NBS基序的遗传距离在21.7之内。因此,B-NBS是一个香蕉NBS-LRR类抗病基因类似序列。本研究将为香蕉抗病基因克隆和抗病机理研究提供新的抗病候选基因资源。     

小麦ramosa3基因cDNA的克隆及其编码序列分析

为进一步研究小麦花序形态建成,依据Genbank中已公布的玉米等禾本科植物中 ramosa3 基因的保守区和小麦 EST序列设计特异性引物,利用 RT-PCR 从普通小麦中国春幼穗总RNA 中克隆得一长度为657 bp的cDNA片段,该片段编码 219 个氨基酸.蛋白序列比对表明,该编码序列与禾本科植物 ramosa3有较高的同源性,可推测此基因是小麦的 ramosa3基因.蛋白质结构预测表明,小麦 ramosa3具有6-磷酸海藻糖酶的结构特征,属于TPP酶家族成员.     

橡胶树HbDHN1基因克隆及表达分析

采用Macroarray印迹杂交技术从本实验室构建的橡胶树机械伤害诱导的树皮抑制性差减杂交(SSH)cDNA文库中检测到1个差异表达EST.采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,包括124 bp的5'端非编码区,337 bp的3'端非编码区和1个编码224个氨基酸的开放阅读框.该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SK2类脱水素蛋白.命名为H6DDHN1,与其它植物的SK2类脱水素蛋白具有49.0%～68.2%的氨基酸序列同源性.RT-PCR分析表明,机械伤害对HbDHN1基因的表达没有明显影响,受伤组织的脱水显著上调该基因的表达.     

小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定

为了克隆小麦干旱应答基因,构建了干旱诱导的小麦cDNA文库,并从文库中分离了一个DREB类转录因子基因TaDREB6.序列分析表明,TaDREB6具有一个837bp的开放阅读框和242bp的3非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的AP2/EREBP结构域.采用该基因特异引物PCR技术对一套中国春缺体-四体材料进行扩增,将TaDREB6定位于3A染色体上.这是首次将一个小麦DREB基因定位在特定的染色体上.RT-PCR分析表明,TaDREB6基因受干旱胁迫诱导表达;亚细胞定位结果表明,TaDREB6-hGFP融合蛋白定位于细胞核中.上述结果说明,小麦TaDREB6基因编码的蛋白可能在细胞核内对干旱胁迫应答反应起调控作用.     

小麦ramosa2基因的克隆与序列分析

为了研究ramosa2基因在小麦中的功能,以普通小麦(Triticum aestivum L)中国春基因组为模板,玉米、高梁、水稻和大麦中ramosa2基因保守序列为参考设计引物,扩增到1条全长为771 bp的目的片段.序列分析表明,该核酸序列与高梁、玉米、水稻和大麦中ramosa2基因的同源性高达82.9%～95.2%;其预测编码的氨基酸序列与高粱、玉米、水稻和大麦ramosa2基因的氨基酸序列同源性达79.2%～95%.     

大麦和小麦抗病性的分子基础研究进展

抗病性是大麦和小麦不可或缺的重要性状。本文介绍了大麦和小麦的抗病分子基础研究进展:从大麦和小麦分离出的抗病基因编码蛋白的结构具有相似性及独特性;从大麦中鉴定、分离出抗病基因介导、激活防御反应所必需的一些附加基因,并发现在双子叶植物与禾谷作物的抗病防御反应中一些信号传导基因具有保守性,有利于对大麦和小麦抗病信号传导途径的理解和同源基因的分离;从大麦和小麦中分离出病原诱导表达的一些防卫基因。本文讨论了利用已克隆的抗病基因结构保守性和比较基因组学进一步分离克隆大麦和小麦抗病基因的潜力与限制以及利用克隆的抗病基因进行生物工程育种的可能性与局限性;还提出了今后发展方向,即不仅将继续深入研究显性单基因的分子机制,还将揭示持久的多基因抗性和广谱的非寄主抗性的分子基础。     

基因枪介导的小麦叶片瞬间表达体系的优化及应用

麦类作物的叶片单细胞瞬间表达是一种高效而快速的基因功能验证方法,尤其适用于麦类作物与白粉病菌的互作系统,但由于影响参数较多、参检基因表达频率低而尚未广泛应用。本研究使用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,对影响表达效率的多个转化参数进行优化,筛选出表达频率最高的参数组,即小麦叶片采用固体保鲜培养基固定,钨粉用量为每枪300μg,质粒DNA用量为每枪750ng,可裂膜氦压为1 350psi,可裂膜与受体膜距离6mm,受体与阻挡网距离6cm,与先前报道的方法相比表达频率有显著提高。应用上述参数在感病小麦品种离体叶片中过量表达一个已知具有抗白粉病功能的簇毛麦SGT1基因,结果表明该基因瞬间表达使互作细胞吸器指数降低,表现为对白粉病菌侵入和吸器形成具有抑制作用,在一定程度上增强了表达细胞对白粉病菌的抗性,使目标基因的抗性功能再次得到印证。本研究还进一步运用该优化体系开展瞬间表达介导的基因沉默(TIGS)实验,将携带抗白粉病基因Pm21的抗病小麦品种南农9918和感病小麦品种扬麦158中的内源SGT1和RAR1分别或同时沉默,结果显示南农9918的叶片表皮与白粉菌互作细胞的吸器指数增高,在一定程度上降低了表达细胞对白粉菌的抗性。而扬麦158中互作细胞的吸器指数较对照变化不显著。说明这两个基因均分别参与了Pm21介导的抗白粉病信号途径,且二者共同作用与白粉病抗性关系更加密切。     

A ω-secalin contained decamer shows a celiac disease prevention activity

Celiac disease (CD) is an autoimmune permanent enteropathy that is triggered in susceptible individuals after the ingestion of gluten, a storage protein fraction presents in wheat, rye and barley endosperm. Specific gluten peptides can bind to HLA-DQ2/8 and induce lamina propria CD4⁺ T cell responses causing damage of the small intestine mucosa. Recent studies suggested that beside immunodominant and toxic epitopes, wheat gluten also contains epitopes capable of preventing the mucosal response in vitro. Among them, a decapeptide (QQPQDAVQPF) from wheat was reported to have an antagonist effect on the agglutination of K562(S) cells and celiac T-cell activation, although the corresponding nucleotidic sequence remained unknown. This study was therefore designed to clone the sequence encoding the protein carrying the decapetide with CD protective properties. A ω-secalin gene encoding containing the decapeptide QQPQRPQQPF was isolated. Although the decapeptide was not identical to the one previously described, QQPQRPQQPF showed the same capability to prevent K562(S) cell agglutination and celiac mucosa immune activation induced by toxic gliadins. The ω-secalin gene was found in wheat carrying the wheat–rye chromosomal translocations 1BL.1RS. The identification of this immunomodulatory gliadin sequence, naturally occurring in cultivars of wheat toxic for celiac patients, might offer new therapeutic strategies for CD.     

基于RNA-seq技术分析野生大麦穗部发育基因的表达谱及其转录动态

为明确野生大麦穗部发育过程中基因表达的动态变化,以来自以色列的野生大麦Mehula 1-2为材料,对其在穗部发育的4个关键时期（开花后3、8、13和18 d)进行RNA-seq分析,并与栽培大麦穗部的基因表达谱进行了比较。结果表明,在野生大麦穗发育的4个时间点共鉴定到17 163个基因,其中11 273个为差异表达基因,包括635个转录因子相关基因;功能富集分析表明,这些差异基因主要富集到物质合成、代谢过程、物质运输、抗逆等相关过程或通路上;野生大麦和栽培大麦穗部基因的表达谱比较分析发现,两者共同表达的基因显著富集到细胞器、催化、代谢、调节及抗逆等相关通路上,而在特异表达基因方面,栽培大麦主要集中于甲基转移酶、次生壁生物合成、核糖体蛋白等相关基因,野生大麦主要集中于逆境抗性、花青素合成、钙调蛋白等相关基因。本研究发掘的与穗部发育相关的关键基因,丰富了大麦穗部遗传改良基因资源,为进一步解析野生大麦穗部发育关键基因的表达特性和调控机制奠定了基础。     

小麦抗条锈基因Yr10的抗病通路研究

小麦抗条锈病基因Yr10作为全生育期抗性基因,对国内大部分的条锈菌生理小种表现抗性,为探究Yr10介导的抗病通路,以小麦AvocetS(AvS)和其近等基因系AvS Yr10NIL(AvS+ Yr10)为材料,接种条锈菌CYR31后分别构成亲和与非亲和体系,通过分析含有抗病基因Yr10非亲和体系中的信号分子变化,比较非...     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用,本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141,并进行转录组测序,发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现,该基因的开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明,该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明,该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示,HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高,但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近;进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析,发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类,其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,青稞在遭受条纹病菌侵染时,HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

青稞B-hordein基因对小麦面粉加工特性的影响

B组醇溶蛋白是大麦的主要贮藏蛋白之一,其组成及含量与大麦的营养品质和加工品质密切相关。为探究大麦B组醇溶蛋白对小麦面粉加工特性的影响,以转青稞B-hordein基因的小麦转基因高代株系(T4、T5代)及其受体品种龙麦30为材料,分别对转B-hordein基因小麦高代株系及龙麦30进行分子检测、农艺性状测量、近红外分析和粉质分析。结果表明,转B-hordein基因小麦高代植株均为阳性植株;在农艺性状方面,转B-hordein基因小麦与龙麦30无显著差异;在品质方面,转B-hordein基因小麦的蛋白质含量、湿面筋含量的平均值均极显著高于龙麦30;粉质分析结果也表明转B-hordein基因小麦的粉质参数优于龙麦30。由此推测,B-hordein基因的成功转化能够改善小麦的面粉加工特性。     

西藏青稞和小麦品种的条锈病抗性鉴定

为明确西藏青稞、小麦品种的条锈病抗性水平,以合理利用抗病品种防控条锈病,采用常规接种法,利用当前西藏大麦条锈菌的流行菌系PSH1和PSH2、小麦条锈菌的流行小种CYR33和CYR32,分别对供试的15个青稞、26个小麦品种在温室进行苗期、成株期抗条锈病鉴定,并分析其抗性水平与抗性类型。结果发现,15个供试青稞品种中,仅喜马拉21号对大麦条锈菌菌系PSH1、PSH2兼具苗期和成株期抗性,15个均对小麦条锈菌小种CYR33、CYR32表现抗病。26个供试小麦品种中,19个对小麦条锈菌小种CYR33和CYR32兼具苗期抗性和成株期抗性,所有供试小麦对大麦条锈菌菌系PSH1、PSH2均表现抗病。     

中国大麦种质资源Wx蛋白分析及糯大麦分子标记验证

利用1D-SDS-PAGE分析了中国167份不同直链淀粉含量类型的大麦种质资源Waxy 蛋白类型,发现在低直糯大麦和无直糯大麦两种类型中,可能存在四种生化遗传变异类型。其中有两种与无直糯大麦有关,一种是Wx基因可以正常转录,但转录产生的Wx蛋白无活性,不能催化直链淀粉合成;另一种是Wx基因不能正常转录,既无Wx蛋白产生,也无直链淀粉合成。另外两种与低直糯大麦有关,一种是Wx基因可以正常转录,但转录产生的Wx蛋白活性有限,催化直链淀粉合成的功能降低;另一种是Wx基因不完全正常转录,产生的Wx蛋白数量有限,影响直链淀粉合成。利用4个大麦与小麦的STS标记和2个大麦与小麦的SSR标记对不同Wx蛋白类型进行糯性鉴定,结果表明,迄今利用的Wx基因的STS引物P1可能只适合用于CDC Candle遗传类型相同的糯大麦品种或基因型的鉴定。其它标记均不能用于鉴定大麦糯性胚乳表型,因此当前对于糯大麦育种及Wx分子鉴定研究而言,还有待于开发新的分子标记。     

EDS1正调控茄子抗青枯病反应

EDS1(Enhanced Disease Susceptibility 1)在植物抗病过程中起着关键的作用。为进一步研究其在调控茄子抗青枯病中的作用,根据茄子基因组序列设计引物克隆了EDS1,将其命名为SmEDS1。生物信息学分析表明SmEDS1最大开放阅读框包含1 809 bp,编码602个氨基酸残基。其包含该基因家族典型的LP结构域和EP结构域。为了进一步验证其功能,通过VIGS技术沉默茄子抗青枯病材料SmEDS1后接种青枯病病原菌,7 d后植株枯萎,结果表明EDS1正调控茄子抗青枯病。半定量结果表明,SmEDS1沉默后对其他信号基因的表达量有着显著影响,其中MAPK6、RAR1的表达量上调,而MAPK3、SIPK、PAD4、SGT1、TGA、EDR1、NPR1、ICS1、GLUA、EIL1和HSP90等基因的表达量下调,EBF2和ACO5的表达量不受SmEDS1的调控。此结果表明EDS1在调控茄子抗青枯病中起着重要的作用。