饲料中添加裂殖壶菌对斑马鱼抗创伤弧菌感染的影响

【目的】研究饲料中添加裂殖壶菌对鱼类抗细菌感染能力的影响,为裂殖壶菌作为饲料添加剂的应用提供理论基础。【方法】以6个月的成年斑马鱼为研究对象,以基础颗粒饲料为对照组(C组),试验组在基础饲料中添加干重3%的裂殖壶菌(S组),进行28 d饲喂试验。28 d后以创伤弧菌Vibrio vulnificus菌株FJ03-X2对斑马鱼进行攻毒,统计免疫保护率,并收集斑马鱼的肾脏组织提取RNA,逆转录成cDNA,通过Real-time RT-PCR检测相关基因lysozyme和tnfb的表达。【结果】饲料中添加3%裂壶菌能够显著提高斑马鱼感染创伤弧菌后的存活率,相对保护率为42.8%;Real-time RT-PCR检测的结果发现S组的斑马鱼肾脏中溶菌酶Lysozyme的mRNA水平极显著高于对照组(P0.01),而肿瘤坏死因子TNFb的m RNA水平则极显著低于对照组(P0.01)。【结论】裂殖壶菌作为营养添加剂可以提高斑马鱼抗创伤弧菌感染的能力。     

创伤弧菌外膜蛋白OmpU的基因克隆与表达

创伤弧菌是导致鳗鲡产生体表溃疡死亡的重要致病菌。本研究克隆了创伤弧菌FJ03-X2株外膜蛋白基因(ompU),构建含该基因的原核表达载体,命名为pET-32a-ompU,将其转化到大肠杆菌E.coli中进行融合表达。37℃,0.5mmol.L-1的IPTG诱导4h,融合蛋白rompU以可溶形式表达,采用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白,SDS-PAGE显示纯化后的rompU为与预期大小一致的单一条带。将纯化的rompU免疫SD级大鼠,ELISA检测收获的多克隆抗体血清效价,并通过Western-blot证实该OmpU多克隆抗体可以识别创伤弧菌FJ03-X2株中的天然外膜蛋白OmpU。     

创伤弧菌外膜蛋白的分离及其抗原性分析

分别采用Sarkosyl和PMSF法分离、提取鳗源创伤弧菌FJ03-X2的外膜蛋白,并应用SDS-PAGE和Western-blotting分析比较两种方法提取的外膜蛋白的组分和抗原性。SDS-PAGE分析结果表明,Sarkosyl法分离的主要外膜蛋白分子量集中在14～66 kDa之间;而PMSF法分离的主要外膜蛋白分子量分布在14～92 kDa之间。在两种方法中,分子量38 kDa、36 kDa的外膜蛋白均为高丰度蛋白。两种方法提取的创伤弧菌外膜蛋白经SDS-PAGE后,用兔抗创伤弧菌FJ03-X2血清进行Western-blotting,结果显示,兔抗FJ03-X2高免血清能识别绝大多数外膜蛋白组分,说明FJ03-X2菌株的外膜蛋白具有良好的抗原性。其中,分子量分别为66kDa、47 kDa、44 kDa、38 kDa、36 kDa、34 kDa的外膜蛋白呈强阳性反应,是主要的免疫原组分。同时,经比较分析认为PMSF法提取创伤弧菌外膜蛋白的效果更好。     

斑马鱼肿瘤坏死因子(tnfα)及其受体(tnfrsf1a)应答细菌和病毒感染的表达

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,Tnf)作为重要的炎症因子,在抵抗细菌和病毒感染以及清除被感染的细胞等方面发挥着重要的作用。对斑马鱼进行腹腔注射免疫刺激物、细菌和病毒病原,并采用荧光定量PCR技术分析tnfα及其受体[tnf receptor superfamily(tnfrsf)member 1a]在肾脏和脾脏中的表达。实验结果显示:tnfα和tnfrsf1a在斑马鱼各组织中均有常量表达。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和聚肌苷酸-聚胞苷酸[polyinosinic acid-polycytidylic acid,poly(I:C)]能够调控肾脏和脾脏中tnfα和tnfrsf1a的表达。腹腔注射嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染斑马鱼后,tnfα在脾脏(48 h和72 h)和肾脏(72 h)中表达显著升高;tnfrsf1a在脾脏(48 h)表达水平也有显著上调。在注射迟缓爱德华氏菌(Edwardasiella tarda)的斑马鱼中,肾脏的tnfα表达显著增加,但在脾脏的表达则完全被抑制;tnfrsf1a基因在脾脏和肾脏(6 h和72 h)有明显上调。鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus,SVCV)感染斑马鱼后,tnfα和tnfrsf1a在感染早期表达量有显著升高;而且在感染1～7 d中,肾脏的tnfrsf1a始终维持高水平诱导表达。实验结果表明:tnfα和tnfrsf1a在鱼类抵抗细菌和病毒感染过程中发挥重要作用。     

转基因斑马鱼在镉免疫毒性研究中的应用

为开发转基因斑马鱼技术在环境污染物免疫毒性研究中的应用,以转基因斑马鱼Tg(lysC:DsRed2)-Lyz fish为模型,利用斑马鱼胚胎发育技术和定量实时RT-PCR技术,探讨了Cd对斑马鱼仔鱼的免疫毒性及其作用机制。结果表明,0.01μmol·L~(-1)CdCl_2即可显著抑制转基因斑马鱼胚胎的孵化(P=0.013),当暴露浓度增大到0.1μmol·L~(-1)时,斑马鱼胚胎24 h血流障碍和52 h孵化抑制这两个毒性效应都大幅增强,且剂量-效应关系显著。0.1μmol·L~(-1)CdCl2使得溶菌酶(lysozyme C,lyz)标记的斑马鱼仔鱼体内中性粒细胞数量增多,且趋向肝脏部位聚集。免疫毒性的作用机制与斑马鱼仔鱼体内金属硫蛋白相关基因(dMT)和炎症相关基因(serp、tnf)表达的诱导,以及癌症抑制相关基因(ccgn1、chk2、p53)表达的抑制有相关性。研究表明,转基因斑马鱼Tg(lysC:DsRed2)在重金属污染物免疫毒性评价中具有重要意义。     

斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57~(RFP)菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD_(50))、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD_(50)分别为7.90×10~8 CFU/mL和1.14×10~(11) CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。     

创伤弧菌外膜蛋白免疫刺激复合物最小免疫剂量测定

为探讨创伤弧菌Vibrio vulnifiticus外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)免疫刺激复合物(Immune stimulating Complexs,ISCOMs)的抗原性,制备创伤弧菌OMP-ISCOMs腹腔注射免疫欧洲鳗鲡Anguilla anguilla(平均规格为17g·尾-1),通过免疫血清学检测和攻毒保护试验,测定ISCOMs最小免疫剂量。结果表明,于免疫后第30d用FJ03-X2菌株攻毒,免疫组40、20、10、5μg·尾-1的免疫保护力分别为100%、87.5%、75%、50%;免疫血清效价分别为1∶6 400、1∶3 200、1∶800、1∶200。结果说明创伤弧菌外膜蛋白ISCOMs的最小免疫剂量为0.59μg.g-1水温(24±1)℃,并证实了创伤弧菌OMP-ISCOMs具强抗原性。     

创伤弧菌铁调基因fur的原核表达及多克隆抗体制备

应用PCR方法克隆了创伤弧菌Vibrio vulnificus FJ03-X2株的铁调基因fur(Ferric uptake regulator),该基因片段大小为450bp,编码149个氨基酸;以pET32a为表达载体,构建了原核表达质粒pET32a-FUR,表达质粒测序结果表明目的基因与GenBank中报道的创伤弧菌fur基因的同源性达98%以上;诱导表达获得可溶性的重组表达蛋白rFUR。镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化rFUR,SDS-PAGE电泳分析其分子量约33kD。以纯化后的融合蛋白rFUR为抗原,4次免疫SD大鼠,制备抗rFUR蛋白大鼠多克隆抗体。用ELISA方法检测鼠多克隆抗体的效价达到1∶256 000,表明融合蛋白rFUR具有良好的免疫原性。     

RseB影响溶藻弧菌感染花鲈的能力

为了研究Rse基因缺失对溶藻弧菌感染花鲈能力的影响，评估了花鲈感染后的LD50、定殖能力和免疫响应，结果显示，溶藻弧菌野生株LD50为2.013×105CFU/ml，RseB缺失溶藻弧菌LD50为5.526×105CFU/ml，RseB缺失溶藻弧菌毒力下降2.75倍；溶藻弧菌主要在花鲈的鳃部、肠道、皮肤定殖，RseB缺失溶藻弧菌定殖肠空泡化程度更低，鳃组织结构的损坏程度更低；分别对野生株与RseB缺失溶藻弧菌感染的花鲈头肾组织进行转录组测序，发现与免疫相关的差异表达基因一共有236个，其中包括了122个显著上调的免疫基因和114个显著下调的免疫基因，这些基因大部分显著富集在Th1和Th2细胞分化、B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路等特异性免疫通路上，部分基因显著富集在与细胞凋亡相关的通路以及与炎症相关的NF-kappa B信号通路中。综上结果表明RseB缺失溶藻弧菌能引起宿主细胞的免疫反应且毒力有所降低。     

2-甲基异茨醇对斑马鱼氧化磷酸化及免疫相关基因表达的影响

-甲基异茨醇（2-methylisoborneol, 2-MIB）是由多种放线菌土壤生物、蓝细菌等产生的一种挥发性有机物,在水体中广泛存在。2-MIB除了导致鱼类土腥味以外,是否对鱼类造成其它影响尚不得而知。本研究将斑马鱼饲养在2-MIB浓度为42ng/L的水中24h后,进行鳃组织的转录组测序分析,发现2-MIB处理组中有163个基因显著上调,565个基因显著下调。KEGG通路富集显示氧化磷酸化相关的生化过程上调,而免疫相关信号通路发生下调, RT-qPCR进一步显示,2-MIB显著上调氧化磷酸化相关基因ndufb7、mt-cyb、mt-nd4、mt-nd6、mt-co2和mt-atp6的表达,而Toll-like receptor signaling pathway相关免疫基因rela、cd40、ikbkb、mapk8b、mapk3、ripk1l显著下调。超氧化物歧化酶SOD活性在2-MIB暴露后,鳃和肝脏组织中的SOD升高。本研究表明水体中的2-MIB会提高鱼体内活性氧水平,引起细胞损伤,还可能导致相关免疫机能下降。     

创伤弧菌微球口服疫苗的制备及其免疫效果研究

为了研究创伤弧菌灭活疫苗的免疫效果,本研究将实验室保存的创伤弧菌菌株EPL0201经0.3%甲醛灭活,采用海藻酸钠包裹灭活菌液制备了创伤弧菌微球疫苗,通过口服途径免疫健康的珍珠龙胆石斑鱼(Pearl gentian grouper),在免疫后第28天用1×10⁷ cfu/mL创伤弧菌腹腔注射珍珠龙胆石斑鱼,检测了免疫后珍珠龙胆石斑鱼部分免疫相关基因的表达趋势和攻毒后的免疫保护率。创伤弧菌微球口服疫苗的粒径为(34.55±5.33)μm,包覆率为90.5%。测其安全性良好。实时定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)结果显示,与对照组相比,各免疫基因先后出现不同的表达变化。TLR信号通路上的基因TLR1、TLR2、TLR3、TLR5和M y D88及炎性细胞因子IL-1β、IL-12p40和TNF-α在肾脏、脾脏、肝脏和肠组织中都参与免疫应答。TGF-β只在脾脏中有表达。免疫基因在各个组织中的表达变化不同,其中,表达量最高的是IL-1β在脾脏中,最高值为对照组的72.37倍。同一种免疫基因在鱼体不同器官和组织中的峰值表达量...     

促肾上腺皮质激素释放激素对离体斑马鱼卵细胞类固醇激素合成的影响

在硬骨鱼类中,促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)在内分泌、自主神经活动、免疫、渗透压和摄食活动中起着至关重要的作用,但有关CRH是否对斑马鱼卵细胞类固醇激素合成的研究较少。以体外培养斑马鱼卵细胞为实验材料,通过荧光定量PCR技术和放射性免疫方法,检测CRHα和CRHβ处理后卵细胞中CRH受体(CRHR1和CRHR2)及类固醇激素合成相关基因的表达变化,并检测培养液中雌二醇和孕酮的含量。结果显示,100 nmol/L CRHα和CRHβ处理后,卵细胞中CRHR1基因表达量显著上调,CRHR2基因表达无显著变化。CRHβ显著增加卵细胞中cyp19a1a基因表达,CRHα和CRHβ对其他类固醇激素合成相关基因的表达无显著影响。添加CRHα和CRHβ后,培养液中雌二醇的含量显著降低,孕酮的含量无明显影响。提示CRH可能通过斑马鱼卵细胞中CRHR1调节雌激素合成相关基因的表达抑制雌激素的合成。     

意大利蜜蜂4、5和6日龄幼虫肠道发育过程中差异表达基因的趋势分析

为探讨意大利蜜蜂(简称意蜂)幼虫肠道发育过程中的基因表达谱和基因差异表达信息,研究基于前期已获得的高质量的意蜂幼虫肠道转录组数据,利用STEM软件对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道的差异表达基因(DEGs)进行趋势分析,进一步通过相关生物学软件对显著上调趋势包含的DEGs进行GO与KEGG代谢通路富集分析及表达量聚类分析。趋势分析结果显示,5 920个DEGs共聚类在8个基因表达模式,其中935个DEGs聚类在1个显著上调趋势。GO富集分析结果显示,显著上调趋势包含DEGs富集于39个GO条目,富集基因数最多的为结合,其次是细胞进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,显著上调趋势包含DEGs富集于94个代谢通路,富集基因数最多的是嘌呤代谢、内质网蛋白质加工和内吞作用。表达量聚类分析结果显示,随着意蜂幼虫肠道发育时间的延长,代谢和免疫相关通路富集基因的表达水平逐渐增强。研究提供了意蜂幼虫肠道发育过程的基因表达谱和基因差异表达信息,揭示了基因表达规律,为深入研究意蜂幼虫肠道发育的分子机制打下了一定基础。     

投喂蚕豆对草鱼免疫器官超微结构和免疫基因表达的影响

为研究草鱼摄食蚕豆后免疫功能变化及转投30 d人工饲料后免疫增强效果,在草鱼摄食蚕豆30、60、90、120及150 d(转投饲料30 d)时,检测肠道、头肾、肝脏等器官超微结构及C-type lysozyme、IFN-I、TNF-α等免疫基因表达变化。结果表明:1)饲喂单一饲料蚕豆的草鱼,其肠道、头肾、肝脏等3个重要免疫器官受到严重损伤,转投饲料30 d后其病变并未显著好转;2)免疫基因C-type lysozyme、IFN-I、TNF-α、IgM和MHC-I的表达在30～120 d均被抑制,转投饲料30 d后,头肾中C-type lysozyme、IL-1β、IFN-I、IgM、MHC-I以及肝脏中IL-1β、TNF-α、IFN-I、IgM、MHC-I的表达量有所增加。综上,草鱼摄食蚕豆后其免疫功能受到显著抑制,而转投30 d饲料对脆肉鲩的免疫机能具有一定的恢复作用。     

CpG-ODN不同免疫途径对仔猪免疫增强效果的研究

以不同途径进行CpG-ODN免疫仔猪后,再以活的肠毒素大肠杆菌为模式病毒对仔猪进行攻毒,观察各组新生仔猪的腹泻情况,并测定血液中特异性抗体的含量、肠道中大肠杆菌数量的变化。结果表明,100μg/kg CpG-ODN+20%苦杏仁苷酶(Em)通过滴鼻免疫后,血液中特异性抗体含量约为对照组的3倍,肠道大肠杆菌数量显著下降,与对照组差异显著,同时腹泻症状明显减轻,仔猪体重增加明显。这显示了CpG-ODN通过滴鼻免疫能够显著提高新生仔猪对肠道病原细菌感染的抵抗能力。     

毒死蜱和百菌清对斑马鱼早期发育阶段的联合毒性效应

为评价毒死蜱和百菌清的单剂毒性和联合毒性,以斑马鱼为受试生物,采用静态法和实时荧光定量PCR方法,研究毒死蜱和百菌清单剂,以及二元组合时对斑马鱼胚胎的急性毒性和对斑马鱼幼鱼性腺轴相关基因的影响。结果显示,毒死蜱和百菌清对斑马鱼胚胎分别表现为中等和高等毒性,96 h-LC₅₀(半致死浓度)分别为2.139 mg·L^-1和0.353 mg·L^-1。毒死蜱和百菌清联合作用类型为协同作用,联合暴露时,对斑马鱼胚胎的96 h-LC₅₀分别为0.38 mg·L^-1和 0.063 mg·L^-1。中浓度(26.7 μg·L^-1)和高浓度(106.7 μg·L^-1)的毒死蜱可以诱导斑马鱼幼鱼体内芳香化酶基因(CYP19α)、卵黄蛋白原基因(VTG1、VTG2)和雌激素受体基因(ERα、ERβ1、ERβ2)不同程度的上调表达;低浓度(1.1 μg·L^-1)百菌清诱导斑马鱼体内VTG1、VTG2、ERβ1和ERβ2基因的上调表达;低浓度(6.7 μg·L^-1毒死蜱+1.1 μg·L^-1百菌清)二元组合会引起斑马鱼体内VTG1、ERβ1、ERβ2和ERα基因下调。说明毒死蜱和百菌清对斑马鱼幼鱼具有雌激素内分泌干扰效应,但毒死蜱和百菌清二元组合对斑马鱼幼鱼的雌激素内分泌干扰效应降低。在评估农药对水生生物的危害时,应充分考虑复合污染时的联合效应。     

RNA干扰PhCatC1/2基因对波纹龙虾相关免疫基因表达的影响

初步研究RNA干扰PhCatC1/2基因对波纹龙虾(Panulirus homarus)相关免疫基因表达的影响，采用qPCR技术检测PhCatC1/2、PhTlr13、PhLys和Phβ-G基因的表达，并观察肝胰腺组织的变化情况。结果表明：注射PhCatC1-dsRNA后，PhCatC2表达量比对照组显著下降(P<0.05),与对照组相比PhTlr13基因表达量在前期呈现显著升高，后下降的趋势，PhLys和Phβ-G基因的表达量均随dsRNA干扰时效的增加而增加；沉默PhCatC2基因后PhTlr13和Phβ-G基因的表达量随dsRNA干扰时效的增加而增加，PhCatC1基因表达量呈现下上调交替的趋势，PhLys基因表达量表现出先下调后上调的趋势。通过PhCatC1/2基因沉默后的分析初步推测，波纹龙虾可能通过促进Toll样受体和溶酶体通路来参与免疫应答，得出PhCatC1/2基因具有免疫功能。     

创伤弧菌FJ03-X2胞外产物对欧洲鳗鲡的致病性和免疫原性分析

以70%饱和硫酸铵盐析法制备鳗源创伤弧菌生物1型高致病菌株FJ03-X2的胞外产物(ECPs),攻毒试验表明,该ECPs对鳗鲡无致病力;SDS-PAGE分析表明,该ECPs由约36 ku为主的系列蛋白条带组成。制备ECPs的免疫刺激复合物(ISCOMs),以20μg/尾的剂量腹腔注射免疫规格为15~20 g/尾的欧洲鳗鲡,ELISA分析表明,21 d和28 d时的血清抗体效价约为1∶1 280,免疫印记显示,ECPs中分子量为36 ku以上的蛋白成份可被免疫欧洲鳗鲡血清所识别,是构成ECPs的主要免疫原;免疫保护试验表明,免疫欧洲鳗鲡显示出较高的免疫保护力。试验结果也显示出,单纯以ECPs等剂量腹腔注射免疫欧洲鳗鲡,不能激发欧洲鳗鲡产生较高滴度的血清抗体,免疫欧洲鳗鲡也未能产生有效的保护性免疫应答。     

沙棘对大鼠胸腺基因表达谱的影响

通过对大鼠胸腺进行基因表达谱分析,评价沙棘对大鼠胸腺基因表达谱的影响。结果表明:与空白对照组比较,服用沙棘组出现表达差异基因共15条,其中ratio>2的上调基因11条,而ratio<0.5的下调基因4条,涉及免疫细胞因子、细胞凋亡等相关基因。可见沙棘影响了胸腺基因的一系列表达,这些基因的表达可能为从分子水平探讨沙棘促使T细胞生长提供基础。     

家蚕感染球孢白僵菌后4种抗菌肽基因的表达分析

【目的】阐明家蚕(Bombyxmori)抗菌肽对球孢白僵菌感染的应答模式,为揭示家蚕及鳞翅目昆虫抗真菌机制提供参考依据。【方法】利用实时荧光定量PCR检测家蚕被球孢白僵菌感染后抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme的表达情况,比较4种抗菌肽在家蚕脂肪体、血淋巴、马氏管和中肠中不同时间点的表达差异。【结果】经球孢白僵菌诱导后,cecropinA基因在家蚕脂肪体中的最高上调表达倍数为10.2倍,在血淋巴中的最高上调表达倍数为13.2倍,在马氏管中感染初期显著上调表达(P<0.05,下同),在中肠中感染后期显著上调表达;gloverin2基因在家蚕脂肪体中出现2次上调表达过程,最高上调表达倍数为15.7倍,在血淋巴中感染前期呈上调表达,在马氏管中略呈下调表达,中肠中的gloverin2基因在接种后16~48 h呈显著上调表达,最高上调表达倍数为6.7倍;lebocin1/2基因在家蚕脂肪体和血淋巴中的最高上调表达倍数分别为19.4和22.4倍,在马氏管中仅在接种后16 h呈显著上调表达,在中肠中则是接种后24~48 h呈显著上调表达;lysozyme基因在家蚕脂肪体中显著上调表达,在血淋巴和马氏管中感染初期也呈显著上调表达,但在中肠中的表达无明显规律。【结论】cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因在球孢白僵菌侵染家蚕的过程中均不同程度地被诱导上调表达,尤其在家蚕脂肪体和血淋巴中较明显,由此推测这4种抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染过程中发挥重要作用。