柑橘响应黄龙病侵染的韧皮部蛋白2基因CsPP2B15的克隆与表达分析

黄龙病病原菌诱导柑橘筛孔胼胝体过度积累是其致病的一个重要因素。柑橘韧皮部蛋白（Phloem Protein,PP）在筛孔胼胝体积累中起着重要作用。为研究柑橘韧皮部蛋白响应黄龙病亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）侵染的功能,克隆获得了一个响应黄龙病侵染差异表达的PP基因CsPP2B15的编码区和长1.5 kb的启动子序列,并以高感品种锦橙和耐病品种酸柚老叶和嫩叶为材料,进行基因表达分析。结果发现,CsPP2B15在高感品种锦橙嫩叶中受CLas诱导显著上调表达,而在耐病品种酸柚嫩叶中受CLas诱导显著下调表达,且在叶肉中的表达量显著高于叶脉。嫩叶和嫩梢被认为是柑橘响应黄龙病侵染的早期原初侵染部位。因此,CsPP2B15可能在CLas侵染柑橘早期中起重要作用。CsPP2B15启动子的顺式作用元件预测分析发现,CsPP2B15启动子含有许多与逆境和激素有关的顺式作用元件。进一步构建了CsPP2B15启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定均表明,CsPP2B15启动子具有较强的韧皮部组织特异性。     

柑橘黄龙病相关水杨酸羧基甲基转移酶基因CsSAMT-1的克隆与表达分析

为研究水杨酸羧基甲基转移酶(Salicylic acid carboxyl methyltransferase,SAMT)在柑橘防御黄龙病(Huanglongbing,HLB)中的作用,克隆获得Cs SAMT~(-1)基因,并以易感HLB锦橙和耐HLB酸柚为试材进行基因表达分析。q RT-PCR结果表明,易感病锦橙中CsSAMT~(-1)在感染HLB后上调表达,且在叶脉中的表达量显著高于叶肉;而耐病酸柚中CsSAMT~(-1)呈组成型表达。外源水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理锦橙和酸柚,均可诱导CsSAMT~(-1)上调表达。HLB侵染前,耐病酸柚叶脉中SA和水杨酸甲酯(MeSA)含量分别为11.85和18.18 ng·g~(-1),显著高于锦橙(0.82和0.01 ng·g~(-1));HLB侵染后,锦橙中SA和MeSA含量明显上升,酸柚中SA含量明显下降,MeSA含量基本保持原有水平。研究表明,Cs SAMT~(-1)可能通过调节SA和Me SA信号分子转换来增强对柑橘黄龙病的抗性。     

柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。     

柑橘中黄龙病菌效应子SDE70的表达特征及寄主互作蛋白解析

柑橘黄龙病菌主要致病种亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,Las)具有完整的Sec依赖型分泌系统,可分泌致病因子(效应子)作用于寄主靶标蛋白或基因,调控寄主的抗(感)病反应。为了研究黄龙病菌Sec依赖型效应子在柑橘中的致病机理及其寄主靶标基因,本研究中从感病‘锦橙’中克隆了Las病原菌Sec依赖型效应子基因SDE70(CLIBASIA₀2470)。生物信息分析显示,SDE70蛋白全长132个氨基酸,N端20个氨基酸为典型信号肽。大肠杆菌碱性磷酸酶活性分析显示,该信号肽具有胞外分泌功能。亚细胞定位显示,SDE70::GFP融合蛋白在洋葱细胞质和细胞核中积累。定量PCR分析发现,耐黄龙病酸柚显症叶脉中SDE70表达量显著低于未显症叶脉,相反,易感黄龙病‘锦橙’显症叶脉中表达显著高于未显症叶脉;‘锦橙’根中SDE70表达量显著高于叶脉,而幼叶叶脉中显著低于老叶。SDE70在不同品种不同症状发育时期以及不同组织中表达差异显著。利用酵母双杂交试验筛选获得26个与SDE70互作的柑橘蛋白。GO富集分析表明,42.3%的蛋白质与细胞内...     

桂林地区柑桔黄龙病发生危害现状与防治对策

桂林地区是我国宽皮柑桔的最适生态区，甜橙的适宜生态区。1994年柑、橙、柚面积达3．7万hm2，年产量29万t，已成为我国新兴的柑桔生产基地，也是广西柑桔的主要产地。柑桔业已成为桂林地区农业经济的支柱产业之一。但是，近二十年来，桂林地区柑桔业受黄龙病危害逐年严重，已成为生产上急待解决的问题。1柑桔黄龙病发生历史与现状中国柑桔研究所和广西柑桔黄龙病研究组于1961～1965年，就桂林地区黄龙病问题进行了概查，在荔浦茶城乡过村和城关乡沙街村都发现有零星病树，说明桂林地区南部县早在六十年代已有黄龙病发生。一九七四年赵学源…     

脐橙果实上疫菌褐腐病的发生与防治

湖北省兴山县是全国柑桔优势栽培区域之一,2011年全县柑桔面积5 667hm2(8.5万亩),产量7万t,以脐橙、锦橙和夏橙为主。柑桔疫菌褐腐病,又称为疫腐病、褐腐病等,病原为多种疫霉,以前常见为害主干基部,造成树皮腐烂,即"脚腐病"。在广东对柚的果实为害较严重[1-2]。2011年在兴山县古     

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶(CsADH1)基因进行克隆测序分析,结果表明,CsADH1的CDS序列长为1143bp,编码380个氨基酸。蛋白质结构预测显示,CsADH1含有乙醇脱氢酶Gro ES(ADH_N)和ADH_zinc_N保守结构域。进化树分析显示,CsADH1蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的ADH蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,CsADH1蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料,q PCR分析显示CsADH1在感病根和叶脉中均上调表达,且根中的表达水平是叶脉中的10倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明,Zn、水杨酸(SA)、生长素(IAA)和脱落酸(ABA)均显著诱导CsADH1上调表达,并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明,CsADH1可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。     

不同柑橘属种质对柑橘褐斑病菌的抗性评价

【目的】探讨不同柑橘种质及‘梨橙2号’ב晚蜜2号’部分杂交种对柑橘褐斑病菌Alternaria alternata的感病程度及抗性分级标准。【方法】采用室内果实去皮接种观察不同种质的感病程度并根据系统聚类分析法、病斑平均直径法、病情指数法3种抗性评价方法对抗病性进行分级。【结果】大部分宽皮柑橘类种质易感病;甜橙类、柚类和柠檬类种质较抗病。参试的54份种质划分为高抗、抗病、中抗、感病、高感5类,未发现免疫种质;‘胡柚’、‘强德勒’、‘华盛顿脐橙’和‘梁平柚’4个品种为高抗品种。‘梨橙2号’ב晚蜜2号’杂交种抗病性出现分离,可以进行遗传分析。【结论】宽皮柑橘种质及其杂交种和葡萄柚易感病。     

丹参细胞分裂素调控因子序列特征分析

细胞分裂素通过双元信号系统感知外界环境刺激并作出应答。其中细胞分裂素响应调控因子（response regulator,RR）是该双元信号系统中的重要构成。采用生物信息学的方法,对丹参（Salvia miltiorrhiza）细胞分裂素调控因子进行序列特征和组织表达特性分析。结果发现,丹参基因组中共有15个丹参细胞分裂素调控因子SmRR,序列比对与系统发生分析表明,SmRR1 ~ SmRR7与拟南芥A类RR亲缘关系比较接近,划分为A类RR,SmRR8 ~ SmRR15与拟南芥B类RR亲缘关系近,归为B类;在A类SmRR中,REC接受域含有保守的DDK残基,因此这些基因被推测有完整的功能,B类SmRR具有高度保守Myb_SHAQKYF结构域。两类SmRR的内含子、外显子组成也具有相对的保守性,顺式调控元件的分析发现,SmRR存在很多胁迫和生长调节物质的响应元件。表达量热图显示A类和B类SmRR基因分别在叶和根中表达量较高。     

柑桔疮痂病的抗病性测定及柑桔实生苗抗病性状的分离

试验共使用93个柑桔栽培品种与从16个杂交组合中获得的1170株杂交实生苗,研究疮痂病的抗病性状在柑桔类植物中的分布范围及第一代杂交实生苗中抗病性状的分离情况,结果如下: 1.在93个栽培种中,有59个(约60％)抗病,25个(约30％)耐病;9个(约10％)感病。如果按田中柑桔分类系统看:在每一个组(Scction)中均有抗病品种分布,但大多数抗病种类是属于柚类、橙类及蜜柑类。 2.按照亲本抗性程度不同,将杂交组合分为5个群。在杂交组合抗病×抗病、抗病×耐病,或耐病×抗病、抗病×感病,抗病     

抗菌肽-人溶菌酶融合基因的构建及转入锦橙后的表达分析

为了研究抗菌肽和人溶菌酶对柑桔溃疡病和黄龙病等的协同抗性,利用连接多肽2A编码序列连接抗菌肽cecropin B(CB)和人溶菌酶human lysozyme(HLy)基因,构建了融合基因CB:HLy及其超量表达载体p35S::CB:HLy。利用农杆菌介导法,将该载体转化至锦橙上胚轴。通过GUS化学染色及PCR鉴定,获得转基因植株32株。Real-time PCR证明了融合基因在转基因锦橙中得到了高效表达。本研究为柑桔溃疡病的抗性研究提供了材料。     

琯溪蜜柚黄龙病的田间诊断及防控技术

柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害。中国有柑橘栽培的19个省（区）中已有11个遭受黄龙病为害。在柑橘类中至今未发现抗黄龙病品种与穗砧组合,但品种问抗性有差异。桠柑、蕉柑、福橘感病后迅速衰退;温州蜜柑和甜橙相对耐病;柚类与金柑较耐病。枳（Poncirus trifoliata）感病不表现症状,但无助于改变接穗的抗性。黄龙病病原被认为是一种分布限于韧皮部筛管细胞且难培养的革兰氏阴性细菌,国内外虽有成功培养的报道,但均未获得广泛的认同。     

用过氧化物酶同工酶对柑桔分类的探讨

用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳测定了金柑属(Fortunella)、枳属(Pon-cirus)和柑桔属(Citrus)30个分类群花瓣的过氧化物酶同工酶。根据谱带的异同,分析了彼此之间的亲缘关系。结果表明,以上三属分别具特有的谱带;柑桔属中典型的基本种枸橼(C.medica)、柚(C.grandis)、宜昌橙(C.icha-ngensis)谱区狭小,集中在P_(x20)以前;四季桔(C.madurensis)可能是罗纹(Fortunella japonica)与柑桔属植物的属间杂种;枸橼柠檬类可分为亲缘关系密切的三个组群。过氧化物酶同工酶可用来鉴别某些品种、品系。此外,宽皮柑桔酶谱类型复杂,有待进一步研究分析。     

长春花组织培养柑桔黄龙病病原类细菌的初步研究

柑桔黄龙病是由类细菌(BLO)引起的柑桔病害,对柑桔生产造成很大的危害。类细菌属难培养菌,虽然有过其分离培养的报道,但未能严格按照柯氏法则予以确定。另外,要从病株中获得一定量较纯的病原也非常困难,所以要对该病原的理化性质进行研究困难很大。现将用感病的长春花组织培养柑桔黄龙病类细菌的初步结果报道如下。 一、材料与方法 感病的长春花材料由本实验室提供。     

金沙柚及其近缘种质基于SSR分子标记的遗传多样性分析

应用SSR分子标记对4份不同来源的金沙柚种质及4份金沙柚近缘种质的遗传多样性进行分析。结果表明,通过筛选的26对引物,共检测到等位基因92个,多态性为53.68%;每对引物可检测到的等位基因数目为2~8个不等,平均每对引物扩增出3.54个等位基因。8份种质的亲缘关系较近,相似系数为0.729~0.924。在相似系数为0.738时,8份种质可以被划分为金兰柚组和沙田柚组两个组。     

柑橘响应黄龙病菌侵染的NAC基因的克隆及表达分析

挖掘柑橘抗黄龙病（Huanglongbing,HLB）基因是抗病育种的基础和关键。以感染黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)早期（2个月）锦橙根和叶片中脉比较转录组数据为基础，筛选到9个响应柑橘黄龙病侵染诱导的NAC基因，从中选3个差异表达水平较高的基因克隆，分别命名为Cs NAC21/22、Cs NAC68和Cs NAC78。生物信息分析表明3个基因均符合NAC基因家族的特征；烟草亚细胞定位结果表明，Cs NAC68定位在细胞核，Cs NAC21/22和Cs NAC78定位在细胞核和细胞质。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明，3个候选基因在易感HLB的锦橙、耐病的马蜂柑和高耐病的九里香的组织和病原菌诱导表达特征呈现明显差异。以健康植株为对照，Cs NAC68和Cs NAC78主要在锦橙的根中响应CLas感染，显著上调表达，Cs NAC68在九里香叶肉和马蜂柑根中响应CLas感染，显著上调表达；Cs NAC21/22主要在锦橙根和马蜂柑叶肉中显著下调表达。以‘锦橙’叶片为试材通过q RT-PCR分析候选基因响应SA、J...     

红心柚和美国枸橼杂种后代对柑橘溃疡病的抗性评价

为了探究枸橼对柑橘溃疡病(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)的抗性遗传规律,以感溃疡病品种红心柚为母本,与抗溃疡病种质美国枸橼进行杂交,获得了F₁代杂种,并以F₁自交后获得了F₂代。对F₁杂种进行活体叶片注射接种鉴定,对所有F₂代253株进行离体叶片注射接种鉴定,随后对其中的225株F₂活体叶片进行注射接种鉴定,并对部分F₂代活体叶片接种后进行溃疡病菌定量分析。鉴定结果表明,红心柚和美国枸橼杂交获得的75个F₁全部为感病,没有抗感性状分离。对253株F₂植株离体叶片鉴定结果显示,76株表现为抗病,177株表现为感病。对225株F₂植株活体叶片鉴定结果显示,72株为感病,症状与感病品种‘冰糖橙’类似;118株为较感病,发病程度较‘冰糖橙’轻,与感病亲本红心柚的病症相似;10株为较抗病,抗性接近于抗病亲本美国枸橼;4株为抗病,抗性与抗病种质...     

柑橘超量表达CsNBS-LRR通过SA信号途径增强对溃疡病抗性

克隆了柑橘CsNBS-LRR基因,分析该基因在柑橘溃疡病菌（Xcc）、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导下的表达特征,通过在晚锦橙中超量表达验证其功能。结果表明,CsNBS-LRR的开放阅读框为3 633 bp,编码1 210个氨基酸。其在感病品种晚锦橙中受Xcc诱导下调表达,而在低感品种四季橘中上调表达;在四季橘中受水杨酸诱导明显上调表达,而晚锦橙中上调幅度较小;两品种CsNBS-LRR受茉莉酸甲酯诱导均不明显;超量表达载体转化晚锦橙获得4个阳性植株;抗性评价表明超量表达CsNBS-LRR明显提升了转基因植株对柑橘溃疡病的相对抗性（病情指数为野生型的75% ~ 88%）;转基因植株中水杨酸含量和水杨酸合成途径中关键基因转录水平明显提高;水杨酸信号途径中的PR基因转录水平也升高。综上所述,CsNBS-LRR是柑橘抗溃疡病的1个抗病基因,它可能通过对水杨酸途径的调控一定程度上增强柑橘对溃疡病抗性。     

柑橘MAPK基因的生物信息及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

为挖掘柑橘溃疡病抗性关键基因,对柑橘促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因家族进行注释和功能域分析,明确了CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4、CsMPK6和CsMPK19的组织表达特异性和在抗病品种‘金弹’(Fortunella japonica Swingle)和感病品种‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中受病原菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)诱导的表达情况;并对CsMPK19进行了生物信息分析。共注释出12个柑橘MAPK基因家族成员,根据系统发育树将其分为3个亚类,均含有促分裂原活化蛋白激酶(Pkinase)功能结构域。其中CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4-1和CsMPK6在果实中表达水平较高,CsMPK19在叶片中表达量相对较高。CsMPK1的表达在溃疡病抗(感)品种中均受病原菌强烈诱导,且在感病品种中上调的幅度高于抗病品种;CsMPK3和CsMPK6仅在感病品种中病原菌处理早期有较强烈的响应;CsMPK4-1和CsMPK4-2的表达在感病品种中受病原菌诱导上调,而在抗病品种中病原菌处理后低于水处理对照;...     

几个抗疫病性不同的辣椒材料抗病基因同源序列的分离与比较

 根据已克隆抗病基因的保守序列设计简并引物, 对9 个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因组DNA 进行抗病基因同源性序列的特异PCR 扩增, 经序列测定和同源性分析发现14 个抗病基因同源性序列(RGAs) 与辣椒抗疫病作用相关, 其中B 引物扩增的8 个RGAs 与烟草抗花叶病基因N 、拟南芥抗丁香假单菌基因RPS2 和亚麻抗锈病基因L6 的同源性较高, 属于广谱(细菌、病毒、真菌) 抗病基因同源序列; C 引物扩增的6 个RGAs 与番茄抗叶霉病基因Cf2 和Cf9 有较高的同源性, 与抗疫病作用密切相关。研究还发现, 高感疫病的辣椒基因组中也存在抗疫病相关RGAs , 这与已报道的辣椒抗疫病微效QTLs 位点则来于感病亲本基因组的研究结论一致。