禽多杀性巴氏杆菌C48-1株OmpA基因表达与抗原性鉴定

为了研究禽多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白A(Omp A)的免疫原性,根据C48-1菌株Omp A基因序列设计一对特异性引物,采用PCR方法扩增去信号肽的成熟Omp A基因.将去信号肽的成熟Omp A基因扩增片段双酶切后,克隆到p GEX-6p-1表达载体中,构建重组表达质粒p GEX-Omp A,转化宿主菌BL21并经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-PAGE的结果显示,融合蛋白GST-Omp A大小约为63 ku,与预期的分子质量相符.免疫印迹分析结果表明,该融合蛋白与鸡抗Pm血清具有明显的免疫反应,说明Omp A具有良好的抗原性,这为禽Pm Omp A在免疫防御研究中的应用奠定了基础.     

鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A基因表达及抗原性鉴定

根据已发表的Pm70株的序列(GenBank登录号:AE004439)设计了两对引物,用PCR方法扩增了鸭多杀性巴氏杆菌标准株C48-102的外膜蛋白基因A(ompA),扩增的片段为1062bp。将测序结果与GenBank中多杀性巴氏杆菌P52、PM70、T931317、T94289的ompA序列比对结果表明,核苷酸水平上同源性为89.0%～98.9%;在氨基酸水平上同源性为90.7%～99.2%。全ompA序列在大肠杆菌中干扰蛋白的正常表达,因此截断ompA蛋白的信号肽序列,将去信号肽的ompA基因插入到pPRO-EX-Htb载体上,构建了原核表达载体Htb-ompA,转化BL21,并诱导表达,SDS-PAGE结果表明,表达蛋白约为35kDa,与预期的分子量大小相符。Western-blot结果表明,表达的蛋白具有良好的抗原活性。本研究重组蛋白ompA的获得,为敲除ompA基因多杀性巴氏杆菌突变株的血清学检测奠定基础。     

猪多杀性巴氏杆菌5:A型Ts-8株psl基因的克隆和序列分析

根据禽多杀性巴氏杆菌psl基因序列,设计了1对引物,从猪源多杀性巴氏杆菌5:A型Ts-8株中扩增出453bp的psl基因,将其克隆到pMD18-T载体后测序。序列分析表明,该基因与禽多杀性巴氏杆菌T16株的psl基因序列只相差2个碱基,同源性高达99%;与流感嗜血杆菌编码P6蛋白的基因序列同源性为83%。猪psl基因的推导氨基酸序列与禽psl基因、P6蛋白的氨基酸序列同源性分别为100%,87%。结果表明,多杀性巴氏杆菌psl基因在猪和禽的菌株中是高度保守的,而且与P6蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性。     

禽多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆与序列分析

提取禽多杀性巴氏杆菌分离株Pm27基因组DNA,参考GenBank中Pm70株ompW基因序列设计引物,应用PCR技术扩增了细菌ompW基因,将扩增片段克隆到pMD18-T载体后测序。生物信息学分析表明,该基因编码区长度为615bp,编码204个氨基酸;氨基酸序列与参考株Pm70 OmpW蛋白的同源性最高,达98%;与睡眠嗜血杆菌的同源性77%,与琥珀酸产生菌的同源性为69.3%,与霍乱弧菌、大肠杆菌、耶尔森菌的同源性为50%左右。OmpW蛋白前21个氨基酸残基为信号肽序列,潜在的糖基化位点位于第122位氨基酸残基。     

11株禽多杀性巴氏杆菌OmpA基因克隆测序及其序列分析

为了解国内禽多杀性巴氏杆菌流行株（Pasteurella multocida,Pm）OmpA基因的变异情况,参考GenBank中已发表的多杀性巴氏杆菌序列设计一对特异性引物,采用PCR方法对11个禽Pm菌株和3个荚膜型参考株（A,B,D）的OmpA基因进行扩增,将各菌株纯化回收的扩增产物与pMD18-T载体连接,筛选阳性克隆进行测序。结果表明：14个菌株的OmpA基因开放阅读框在1 047～1 077 bp之间,其中长度为1 062 bp的有9个菌株;Signal IP 4.0预测表明,信号肽均为N端21个氨基酸残基,成熟蛋白氨基酸残基数量在327～332之间,推测的分子量为35.19～36.35 kD。与GenBank中12个菌株OmpA基因核苷酸序列比对及遗传进化分析发现,核苷酸同源性为85.3%～100%;氨基酸同源性为83.1%～100%;其中C48-1,1010,9003,890920,921012,xj等6个国内禽Pm分离株OmpA序列同源性为100%。由此可见国内禽Pm菌株OmpA基因非常保守。     

兔源多杀性巴氏杆菌C51-17株ompA基因表达与免疫原性鉴定

[目的]研究兔源多杀性巴氏杆菌C51-17株ompA基因表达与蛋白免疫原性鉴定.[方法]根据GenBank公布的多杀性巴氏杆菌序列AE004439设计引物,经PCR扩增出兔源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompA基因,开放阅读框包含l 062 bp碱基,插入到pGEX-6p-1质粒,构建成功重组表达载体pGEX-dompA,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导高效表达出多杀性巴氏杆菌成熟重组外膜蛋白ompA.[结果]表达产物经SDS-PAGE分析,重组多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompA分子量在63 ku,Western blot分析显示,重组蛋白能与兔抗多杀性巴氏杆菌高免血清呈现免疫反应,表明表达的重组蛋白具有较好的免疫活性.[结论]获得的重组蛋白为家兔多杀性巴氏杆菌病诊断试剂盒和疫苗的进一步研究奠定基础.     

牦牛源多杀性巴氏杆菌ompH基因原核表达及抗原性鉴定

[目的]克隆、表达牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H(ompH)并鉴定其抗原性.[方法]扩增牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的ompH基因,构建原核表达载体pET28a - ompH,转化大肠杆菌BL21( DE3)并诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定表达目的蛋白,利用Western blot检测该蛋白的抗原性.[结果]成功克隆、构建了牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的pET28a - ompH原核表达载体.诱导表达蛋白约38 kDa,Western blot检测重组蛋白具有良好的抗原性.[结论]ompH基因的成功表达为重组OmpH蛋白的血清学检测方法的建立、多克隆抗体的制备及疫苗的研制奠定了基础.     

PCR检测鸭疫里默氏菌的研究

对本研究室分离、鉴定并保存的42株鸭疫里默氏菌(包括8个血清型)、9株鸭源大肠杆菌和4株鸭源禽多杀性巴氏杆菌进行PCR扩增，结果所有的鸭疫里默氏菌均能扩增出809bp的特异性DNA片段，而鸭源大肠杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌均为阴性。试验证明以细菌DNA和全菌体分别作模板，对PCR的扩增结果无影响。经过优化的该PCR方法能检测出的最低DNA量为1pg。     

鹅多杀性巴氏杆菌OmpH的扩增与生物信息学分析

为扩增鹅多杀性巴氏杆菌OmpH基因,预测OmpH蛋白二级结构和B细胞抗原表位,通过PCR扩增测序及生物信息学分析技术对该基因序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导及蛋白质二级结构的初步预测等,探讨了鹅多杀性巴氏杆菌OmpH基因在免疫保护中的作用。结果表明:鹅多杀性巴氏杆菌OmpH基因全长1537bp,ORF包含1056bp编码351个氨基酸;二级结构以无规则卷曲为主,有少量的α-螺旋和延伸带;推测OmpH蛋白有1个细胞黏附位点、3个糖基化位点。该研究为分析鹅多杀性巴氏杆菌外膜蛋白理化特性、制备单克隆抗体和设计表位疫苗等奠定了理论基础。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1株omp基因克隆及序列分析

根据Genbank中禽多杀性巴氏杆菌的omp（outer membrane protein）基因核苷酸序列设计1对特异性引物,应用PCR方法扩增出禽多杀性巴氏杆菌（5∶A）C48-1株的omp基因全长片段,与克隆载体pmD18-T连接后,转化感受态细胞,对经PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的克隆进行测序。结果表明omp基因全长2 376bp,编码791个氨基酸。序列分析表明该菌株与PBA100株、P52株、EU570212、PM70株核苷酸同源性为48.7%～98.6%,氨基酸同源性为34.8%～99.0%。     

禽多杀性巴氏杆菌脂蛋白E基因的原核表达及其对小鼠的免疫原性

根据禽多杀性巴氏杆菌ATCC12 948株脂蛋白E基因(plpE)序列设计一对特异性引物,经PCR从禽多杀性巴氏杆菌C48-1株中扩增获得了全长plpE基因,大小约1kb。将plpE基因片段插入原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-plpE。转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达获得了重组蛋白plpE。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白plpE约为37.8kD,与预期大小相符。Western blot检测结果表明,重组蛋白plpE能与C48-1菌体阳性血清发生特异性反应,用重组蛋白plpE免疫小鼠,二免后2周用10LD50 C48-1菌株攻毒即获得了100%的保护,表明该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步的交叉保护性试验研究和禽霍乱亚单位疫苗研制奠定了基础。     

检测禽多杀性巴氏杆菌PCR方法的建立

为禽多杀性巴氏杆菌感染提供特异、敏感的诊断方法,本研究建立了检测禽多杀性巴氏杆菌PCR方法.该方法能从禽多杀性巴氏杆菌扩增出1条460 bp的特异片段,而无法从大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、禽1型副黏病毒、番鸭呼肠孤病毒和鸭基因组DNA扩增出目的片段.敏感性试验显示该PCR方法最低可检测出1 ng·L-1的细菌基因DNA.     

3株不同毒力巴氏杆菌外膜蛋白H基因克隆及序列分析

参照GenBank中巴氏杆菌外膜蛋白H(ompH)基因核苷酸序列,设计了一对特异性引物,通过PCR方法,扩增了3株不同毒力猪源巴氏杆菌CA4-1株、679-230株、3397A株ompH全基因.PCR产物克隆至pMD18T载体,进行序列分析,发现3个菌株ompH基因完整的ORF大小分别为1008 bp、1008 bp和1047 bp,分别编码336、336、349个氨基酸,它们的前20个氨基酸均组成信号肽.与已知的15个Heddleston血清型的核苷酸及其推导的氨基酸序列比较,核苷酸同源性在83.3%～99.8%,氨基酸同源性在79.2%～99.4%.序列分析结果表明,ompH基因在不同血清型之间具有较高的同源性.     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及荚膜血清分型

为了解各血清型的多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）在四川、重庆、云南的流行情况,对2013-2014年间四川、重庆、云南等地8个规模化养殖场的125份病死猪肺炎样品进行细菌分离,并用PCR方法对分离的多杀性巴氏杆菌进行鉴定及荚膜血清分型。结果表明：从有肺炎症状病死猪的肺脏样品中共分离出11株多杀性巴氏杆菌,其中有7株为A血清型（63.6%）,3株为D血清型（27.3%）,1株为F血清型（9.1%）,没有发现B和E血清型。表明在该区域内,猪肺疫主要是由A型Pm感染引起。另外,此次还分离出了1株较少见的F型多杀性巴氏杆菌。该结果可为上述地区巴氏杆菌病的防治提供科学材料。     

猪D型产毒素多杀性巴氏杆菌毒素分段基因的原核表达

根据GenBank已发表的产毒素多杀性巴氏杆菌（T＋Pm）toxA基因序列（AF240778）设计1对引物,从猪源D型T＋Pm中扩增出toxA基因片段（3858 bp）,再根据toxA基因序列设计3对引物,分别扩增出ZQ（1084 bp）、ZH（1092 bp）、HM（906 bp）3个分段基因,将其克隆至原核表达载体pET32a,转入大肠杆菌BL21中进行融合表达。经SDS-PAGE和West-ern blotting检测分析,发现ZQ、HM基因的表达产物以包涵体形式存在,大小分别为75、50 kDa,ZH基因不表达。动物试验结果表明,HM重组蛋白具有良好的免疫原性、反应原性及一定的生物学活性,而ZQ重组蛋白没有免疫原性、反应原性及生物学活性。通过间接ELISA的方法检测抗毒素的阳性猪血清,结果表明,HM重组蛋白较天然蛋白具有更高的特异性。     

西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌OmpH基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析

本研究旨在分析一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌OmpH基因的遗传进化、分子特征和抗原性。从一株西藏牦牛源B型多杀性巴氏杆菌的全基因组测序中获得OmpH基因序列,对其核苷酸序列进行遗传进化分析,通过生物信息学软件在线对OmpH基因编码的氨基酸序列进行理论分子质量、理论等电点、亲水性和疏水性、跨膜结构、结构域、二、三级结构及抗原性分析。结果表明OmpH基因全长1 002 bp,编码333个氨基酸;遗传进化分析发现,西藏牦牛源Pm的OmpH基因与新疆牦牛源的同源性最近。OmpH蛋白的分子特性分析发现该蛋白为亲水性蛋白,较为稳定,具有信号肽结构,所有序列均在膜外,无跨膜结构,属于分泌型蛋白,在PFAM数据库中存在Porin＿1结构域及低复杂性区域;该蛋白的二、三级蛋白结构分析发现分子同源三聚体构成,其中无规则卷曲占比45.35%,结构较为稳定。抗原性分析OmpH蛋白的保护性抗原的总体预测为0.6945,高出正常阈值0.2945。OmpH具有抗原性的可能性较大,可作为免疫原性蛋白和多杀性巴氏杆菌疫苗的较佳候选抗原。     

大肠杆菌质粒复制子在巴氏杆菌中传代的稳定性研究

首先将多杀性巴氏杆菌谷氨酸脱氢酶的基因gdhA启动子及鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因插入pMD18-T质粒载体的多克隆位点中构建巴氏杆菌表达质粒pMD18T-PGDH-VP2,用该质粒转化禽多杀性巴氏杆菌G190E40株。为了解重组质粒在巴氏杆菌中传代的稳定性以判断其作为重组活疫苗的可能性,将转化菌种在含氨苄青霉素及血清的平板固体培养基上连续传代至第9代,肉眼观察下的菌落形态和显微镜下见到菌体形态与原始菌种无明显差异;每隔3代提取质粒DNA用限制性内切酶切割检查,酶切图谱没有改变;用扩增PGDH的引物,将提取3、6、9代质粒进行PCR检查,均可见约300bp的PGDH基因片段。结果表明,pMD18-T中的大肠杆菌复制子能在巴氏杆菌中稳定传递至少9代,这为构建能在禽巴氏杆菌和大肠杆菌中复制和表达外源基因的穿梭表达质粒打下了基础。     

一株鹅源多杀性巴氏杆菌强毒株的分离鉴定及其血清型鉴定相关基因的克隆

为探索某鹅场鹅巴氏杆菌病疫情发生的原因,采集初诊为鹅巴氏杆菌感染病例的肝脏、心脏等样品进行细菌分离纯化,经过染色镜检、培养特性、生化试验、种与血清型PCR鉴定、致病性试验和药敏试验等进行鉴定,并根据GenBank中多杀性巴氏杆菌血清型相关基因设计引物进行其血清型相关基因的克隆分析。结果显示,分离到1株荚膜A型鹅源多杀性巴氏杆菌,属于多杀亚种,血清型Ⅰ型,具有较强致病性,对实验小鼠最小致死量为5 cfu。该分离菌株具有多重耐药性,仅对头孢三嗪、头孢噻吩、头孢他啶、头孢唑肟和氟苯尼考5种药物敏感。成功克隆的该分离菌株荚膜合成相关基因hyaD hyaC的开放阅读框4 155 bp,与已发布基因序列同源性高达99%;血清型Ⅰ型PCR的扩增基因片段303 bp,与巴氏杆菌C48 1株扩增基因片段序列完全相同。综上,该株血清型Ⅰ型荚膜A型的鹅源多杀性巴氏杆菌强毒株,是鹅场疫情发生的病原,克隆的荚膜合成相关基因和菌体血清型特异性基因遗传相对稳定。     

鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因扩增及序列分析

为了解不同鸭源鸡杆菌菌株外膜蛋白W基因(ompW)的差异性,对不同地域32株鸭源鸡杆菌ompW基因进行扩增、测序,并应用DNAstar/MegAlign和MEGA.5.05软件对其进行比对及遗传进化分析。结果表明:ompW基因存在于所有检测的鸭源鸡杆菌中。全长在630~711bp,编码209~236个氨基酸。与参考株UMN179的ompW核苷酸同源性为88.7%~100%,氨基酸同源性为86.7%~99.6%。不同来源的鸭源鸡杆菌的核苷酸同源率为84.1%~100%,氨基酸同源性为78.7%~99.6%。进化树分析表明,鸭源鸡杆菌ompW序列差异与分离地理位置,毒力无明显的相关性。     

一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因分型及rpoE基因生物信息学分析

为分析本实验室分离保存的一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因型和rpoE基因编码蛋白的生物特性,通过16S rDNA、特异性基因、荚膜分型、脂多糖分型、rpoE基因扩增等分子生物学和生物信息学方法对此株牦牛源多杀性巴氏杆菌进行分析.结果 表明:此株牦牛源多杀性巴氏杆菌为B∶ L2∶ST44基因型,rpoE基因和印度牛源多杀...