桂郁金SSR-PCR反应体系的建立及优化

目的:对桂郁金SSR-PCR反应体系进行建立与优化,使其适合分析桂郁金遗传多样性等研究内容。方法:通过正交设计法对PCR反应体系的引物,模板,2×Taq PCR MasterMix(包括Tap DNA聚合酶,dNTPs,缓冲液等)以及扩增程序进行建立和优化。结果:桂郁金SSR-PCR反应的最佳体系是在15μL的反应体系中,DNA模板2.5μL (25 ng·μL~(-1)),引物1.0μL(1.0μmol·L~(-1)),2×Taq PCR MasterMix6μL,其中Tap DNA聚合酶0.05 U·μL~(-1),Mg~(2+)3.0 mmol·L~(-1),dNTPs0.3 mmol·L~(-1),加ddH_2O至15μL。PCR反应程序的最佳参数设定为变性30 s,退火30 s,延伸45 s,循环35次。结论:建立了桂郁金SSR-PCR反应体系,并通过10份桂郁金材料进行验证,结果显示该体系稳定可靠,可以为桂郁金引物开发,良种选育繁育等相关研究提供参考。     

小桐子SSR-PCR反应体系的优化

采用改良的CTAB法从小桐子嫩叶中提取基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和SSR-PCR扩增检测,结果表明,改良CTAB法提取的小桐子基因组DNA完整性好,纯度较高,可作为SSR分子标记的模板。同时,对影响小桐子SSR-PCR扩增的d NTPs、Taq DNA聚合酶、引物及Mg2+浓度等4个因素进行了优化,优化后的小桐子SSR-PCR扩增的最佳反应体系为:在20μL的反应体系中含有模板DNA 100 ng,d NTPs 0.2 mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶100 U·m L~(-1),引物0.6μmol·L~(-1),Mg~(2+)1.5 mmol·L~(-1)。适宜的扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性1 min,51~53℃(退火温度随引物不同而改变)退火1 min,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸10 min。     

利用正交设计优化白桦的SSR-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对白桦SSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2 ,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了白桦SSR-PCR反应的最佳体系(20μL):DNA100ng,Mg2 浓度为3mmol·L-1,Taq酶0.5U,dNTP浓度为0.5mmol·L-1,引物浓度为0.4μmol·L-1。对白桦SSR-PCR最佳反应体系进行了梯度退火温度,得到的最佳退火温度为59.9℃。     

芒果CDDP分子标记正交优化设计及引物筛选

以芒果基因组DNA为模板,选择正交设计试验对控制DNA保守序列多态性——聚合酶链式反应(CDDP-PCR)的4个因素(模板DNA浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg~(2+)DNA聚合酶用量)进行正交试验,构建了较佳的芒果CDDP-PCR反应体系,含0.50 U Mg2+DNA聚合酶、0.40 mmol·L~(-1)d NTPs、1.00μmol·L~(-1)引物、0.50 ng·μL~(-1)模板DNA,加双蒸水使得总体积达20.00μL.对比四因子对PCR反应的影响,影响最强的因素是含Mg2+的DNA聚合酶,影响最弱的因素是模板DNA.利用供试的20个芒果品种验证了该体系的稳定性和可行性,21条CDDP引物均可扩增出明晰整齐的条带.     

籽用西瓜SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

采用L_(25)(5~6)正交试验设计,对影响目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)的5个因素(Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度和引物浓度)进行优化试验,建立了籽用西瓜SCoT-PCR反应体系:Mg~(2+)2.5mmol·L~(-1)、dNTPs 0.15mmol·L~(-1)、Taq酶1.5U、引物0.5μmol·L~(-1)、模板DNA 20ng,总体积20μL。比较各因素对扩增反应的结果,其中以Mg~(2+)浓度的影响最大,Taq酶用量的影响最小。应用22个籽用西瓜品种验证该体系稳定可靠,并从41个SCoT引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的22个引物,并逐一筛选出最适退火温度。该反应体系的建立为今后利用SCoT标记技术对籽用西瓜种质遗传多样性评价、指纹图谱构建、种质鉴定、分子标记辅助选择育种等研究提供了新的技术手段。     

线辣椒SSR-PCR反应体系优化及多态性标记筛选

以循化线辣椒果实黄色突变体H0809和高代自交系0599-1为试材,采用L_9(3~4)正交试验设计,研究线辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,并对420对SSR分子标记进行筛选。结果表明,最优的反应体系为:总体积20μL,基因组DNA 20 ng,dNTP 100μmol·L~(-1),引物0.6μmol·L~(-1),Mg~(2+)2.5 mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶1.5μmol;通过筛选,获得72对具有多态性的SSR标记,多态性率为17.1%,平均每个标记扩增出2.67个等位基因。本试验建立的SSR-PCR反应体系和筛选的多态性标记可用于线辣椒种质资源分析、分子标记辅助育种、分子遗传图谱构建及基因克隆等研究。     

长柱金丝桃ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为筛选可用于长柱金丝桃遗传分析的最适ISSR-PCR反应体系,采用正交试验对影响ISSR-PCR反应的5个重要因素(Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg~(2+)、引物和模板DNA浓度)进行4水平正交优化,并对退火温度、循环次数进行筛选。结果表明,20μL ISSR-PCR最佳反应体系包括Taq DNA聚合酶1.0 U、dNTPs 0.2 mmol·L-1、Mg2+3.0 mmol·L~(-1)、引物0.4μmol·L~(-1)、DNA模板40 ng,对ISSR-PCR反应的影响程度由大到小为:Taq DNA聚合酶、引物、Mg2+、dNTPs、DNA模板;引物UBC822的最佳退火温度52.7℃,最佳循环次数41,利用优化的反应体系从61条引物中筛选出12条稳定性好、多态性高的引物,验证试验表明优化的反应体系具有较高的稳定性。     

椰子SSR-PCR反应体系的优化

为进一步开发利用椰子种质资源和开展分子标记辅助幼苗早期筛选及遗传育种工作,采用L_9(3⁴)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg4)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg⁽²⁺⁾、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg⁽²⁺⁾2.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、Taq酶0.5μmol、引物0.5μmol/L、退火温度58℃,在该体系条件下,PCR扩增条带最为清晰,该反应体系的优化,为今后应用SSR标记技术为椰子群体结构分析、种质资源丰富度、基因定位和遗传育种等研究奠定工作基础。     

小豆SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为探索适宜小豆SSR-PCR反应的最佳条件以筛选具有多态性的SSR引物,采用L16(45)正交设计优化影响小豆SSR-PCR反应的5个因素(Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq用量、引物浓度、模板DNA用量),利用优化后的SSR-PCR体系,以10份小豆种质为模板,对80对小豆(50对)和绿豆(30对)的SSR引物进行多态性筛选,得出小豆SSR-PCR的最佳反应体系(20μL):Mg~(2+)浓度2.5 mmol/L,dNTPs浓度1.0 mmol/L,Taq活性1.5 U,引物浓度0.6μmol/L,模板DNA用量30 ng。利用优化后的体系在小豆和绿豆引物中筛选出31对条带清晰、多态性丰富、重复性好的SSR引物,有效扩增率为38.75%。小豆SSR-PCR优化体系的建立及多态性引物的筛选为进一步开展小豆遗传育种研究奠定了基础,为小豆遗传多样性分析和遗传图谱库构建等研究提供了技术参数和理论依据。     

绿豆SSR-PCR反应体系的建立与优化

为探究影响绿豆SSR-PCR反应的因素,建立绿豆SSR-PCR最佳反应体系,为绿豆遗传多样性分析、品种鉴定等提供参考。采用正交设计与单因素试验联合分析法,从Mg~(2+)、Taq酶、引物、d NTPs及模板DNA 5个因素对绿豆SSR-PCR反应体系进行优化分析。5个因素中,Mg~(2+)对SSR-PCR结果影响最大。SSR-PCR反应最佳体系为20μL体系中含0.8 mmol/L Mg~(2+)、1.25 U Taq酶、1.4μmol/L引物、1.8 mmol/L d NTPs、25 ng模板DNA。该绿豆SSR-PCR反应体系的建立为进一步利用SSR分子标记技术研究绿豆资源奠定了基础。     

水仙SSR分子标记PCR反应体系的建立与优化

利用单因素梯度试验与正交试验相结合、方差分析与多重比较分析相结合的方法,对水仙简单重复序列—聚合酶链式反应(SSR-PCR)扩增反应体系中的4个因素(DNA、dNTPs、引物及Taq酶)进行优化分析,方差分析表明4个因素对SSR-PCR的影响均达到极显著水平,通过多重比较分析发现SSR引物和Taq酶对总体系的扩增结果影响最大。根据单因素梯度试验与正交试验结果,建立了适合水仙SSR标记分析的最优PCR反应体系:DNA模板2.5 ng·μL-1,10×PCR Buffer(含1.5 mmol·L-1Mg2+),dNTPs 0.25 mmol·L-1,上下游引物各0.50μmol·L-1,Taq酶1.00 U,总体积20μL。该优化体系的建立可为今后水仙SSR分析提供标准化的试验体系,为水仙种质鉴定、品种指纹图谱绘制、遗传多样性分析、群居遗传结构研究和遗传连锁图谱分析等领域提供技术支持。     

太子参ISSR反应体系的优化

通过单因子试验和正交设计,对影响太子参ISSR-PCR扩增效果的因素,如模板DNA浓度、Taq酶浓度、dNTPs浓度、引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数进行优化。确立了可用于太子参ISSR-PCR分析最适宜的反应体系:20μL反应体系中含80 ng模板DNA,0.5U Taq酶,0.4μmol·L~(-1)引物,0.18 mmol·L~(-1)dNTPs;PCR扩增延伸时间为70 s,循环数为35。稳定性试验表明,该体系能在不同太子参品种中扩增出清晰明亮、稳定性、多态性好的条带。     

甜柿SSR扩增反应体系的建立

本试验采用正交试验设计法,对"阳丰"甜柿SSR-PCR体系中DNA模板浓度、MgCl2浓度、dNTPs浓度、引物、Taq酶用量等进行了优化,通过琼脂糖凝胶电泳对谱带进行分析,结果表明体系10为最佳体系:20μL扩增反应体系中,25mmol·L-1 MgCl2溶液1.4μL,10 mmol·L-1 dNTPs混合液0.4μL,10 mmol·L-1引物1.1μL,5U·μL-1 Taq酶液0.4μL,10ng·μL-1 DNA溶液4.0μL。所有参试因素中Taq酶对"阳丰"甜柿SSR-PCR扩增结果影响最大,dNTPs对PCR结果影响最小。     

葡萄SSR-PCR体系优化及其诱变单株遗传多样性分析

利用正交试验设计L16(45)筛选适合葡萄SSR标记的PCR反应体系,对52份葡萄种质进行SSR标记,采用UPGMA聚类法分析葡萄诱变群体和亲本的遗传关系.优化的葡萄SSR-PCR反应体系为:Mg2+1.5 mmol·L~(-1),d NTP 0.2 mmol·L~(-1),Taq酶1.0U,引物0.4μmol·L~(-1),模板DNA 50 ng,总体积20μL.48对引物共扩增出270条带,其中多态性条带249条,多态性百分率为92.2%,有31对引物的多态性百分率达到了100%.每对引物可扩增3~10个等位基因,平均为5.6个.52个葡萄样品的遗传相似系数为0.681~0.889,各诱变单株与‘醉金香’母本的遗传相似系数为0.730~0.859.利用SSR分子标记能将供试验的52份葡萄样品相互区分.在遗传相似系数0.756处将所有葡萄样品分为5个类群,大部分诱变单株与原始母本聚在一起.构建的SSR分子标记体系适用于葡萄种质资源的遗传多样性分析,SSR标记也适合葡萄诱变群体的分子鉴定.     

椰子SSR-PCR反应体系的优化

为进一步开发利用椰子种质资源和开展分子标记辅助幼苗早期筛选及遗传育种工作,采用L_9(3~4)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg~(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg~(2+)2.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、Taq酶0.5μmol、引物0.5μmol/L、退火温度58℃,在该体系条件下,PCR扩增条带最为清晰,该反应体系的优化,为今后应用SSR标记技术为椰子群体结构分析、种质资源丰富度、基因定位和遗传育种等研究奠定工作基础。     

华山松SSR-PCR反应体系优化

[目的]建立华山松SSR-PCR最佳反应体系,为华山松种质资源的分子标记辅助育种、遗传多样性分析及遗传图谱构建研究提供理论参考.[方法]以华山松幼嫩针叶为材料,分别采用试剂盒法、SDS法和改良CTAB法提取华山松基因组DNA,确定华山松DNA最佳的提取方法.通过L16(44)正交试验设计对华山松SSR-PCR反应体系中引物用量(A)、dNTP用量(B)、Taq DNA聚合酶用量(C)和DNA模板用量(D)进行优化,获得华山松SSR-PCR最佳反应体系.[结果]改良CTAB法提取的基因组DNA浓度为92.1~1786.3 ng/μL,OD260/OD280为1.80~2.07,OD260/OD230比值约2.0,条带明亮且清晰,无弥散现象,表明该方法提取效果最佳.正交试验极差分析结果显示,4个因素影响华山松SSR-PCR反应体系扩增效果的主次顺序为A>D>B>C,最优水平组合为A4B2C2D2.正交试验方差分析结果显示,4个因素影响华山松SSR-PCR反应体系扩增效果的主次顺序为A>D>C>B,最优水平组合为A4D2C2B2.结合正交试验16个组合的评分结果,最终确定华山松SSR-PCR最佳反应体系(20.00μL):10μmol/L引物0.35μL,50 ng/μL DNA模板1.00μL,10 mmol/L dNTP 2.00μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶1.20μL,10×PCR Buffer(含Mg2+15 mmol/L)2.00μL,用ddH2O补足至20.00μL.[结论]优化获得的华山松SSR-PCR最佳反应体系可应用于华山松种质资源评价及分子标记辅助育种等研究.     

松阿扁叶蜂SSR-PCR反应体系的优化

以SDS-蛋白酶K法提取的松阿扁叶蜂(Acantholyda posticalis Matsumura)基因组DNA为模板,利用L16(45)正交设计对影响松阿扁叶蜂SSR-PCR反应的主要参数DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物和dNTPs进行优化.结果表明,松阿扁叶蜂SSR-PCR最优的反应体系为25 μL体系中含1.00U Taq DNA 聚合酶、3.00 mmol/L Mg2+、3.75 mmol/L dNTPs、25.00 ng/μL DNA模板和10.00 μmol/L引物.     

国槐SSR-PCR反应体系的建立与优化

利用单因素试验结合L₁₆（4⁵）正交试验设计对国槐SSR-PCR反应体系中的5个主要影响因素(Mg²⁺、引物、dNTPs、ExTaq酶、模板DNA用量)进行优化,确定最佳反应体系为（10μL）:25 mmol/L Mg²⁺1.0μL,2.5 mmol/L dNTPs 0.2μL,10μmol/L上下游引物共0.5μL,5 U/μL ExTaq酶0.05μL,30 ng/μL模板DNA 1.0μL,10×PCR Buffer 1.0μL,ddH₂O 6.25μL。随机挑选4对SSR引物和8个国槐种质对试验确定的最佳反应体系进行验证,均能获得清晰、稳定的条带。该优化反应体系的建立为利用SSR标记对国槐种质资源进行深入研究和利用奠定了基础。     

响应面法优化余甘子种质资源ISSR反应体系

【目的】优化余甘子种质资源ISSR-PCR反应体系,为余甘子种质资源遗传多样性及亲缘关系研究提供基础。【方法】以缅甸、印度、广东、云南、福建等5份来源不同的余甘子种质资源的基因组DNA组成混合的DNA模板,综合单因素试验和响应面分析法,分析引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量、退火温度等反应条件对ISSR-PCR反应体系的影响,优化建立余甘子ISSR-PCR反应体系。【结果】引物浓度和2×Taq Master Mix添加量对扩增效果有较大影响,DNA模板量影响较小;引物浓度和DNA模板量交互作用明显;余甘子ISSR反应体系为引物浓度0.4μmol·L~(-1),2×Taq Master Mix添加量13μL,DNA模板量30 ng,扩增结果与响应面分析模型理论值相对误差仅为9.39%;退火温度为50.5～52.7℃时,随着温度的升高,条带质量变好,数量变多,退火温度为52.7℃时可获得多样性好的清晰条带。【结论】获得ISSR-PCR反应体系为引物浓度0.4μmol·L~(-1),2×Taq Master Mix添加量13μL,DNA模板量30 ng,退火温度52.7℃,扩增循环数35循环,扩增获得的条带清晰、稳定,多样性好,该体系适于余甘子种质资源的遗传多样性和亲缘关系等分析研究。     

基于CGE技术的甘蔗SSR-PCR反应体系优化

【目的】优化基于毛细管凝胶电泳(CGE)技术的甘蔗SSR-PCR反应体系,为甘蔗遗传多样性和亲缘关系研究、分子辅助育种及遗传图谱构建提供技术支持。【方法】基于CGE技术,采用正交试验设计,选择dNTPs浓度、DNA聚合酶量、引物浓度和DNA模板量为考察因素进行优化,确定最佳SSR-PCR反应体系,并用于8个甘蔗种质资源材料的遗传多样性分析。【结果】最佳SSR-PCR反应体系(20μL):dNTPs浓度0.15 mmol/L,DNA聚合酶1.5 U,引物浓度0.50μmol/L,DNA模板量25 ng。利用该体系对8份来自不同国家地域的甘蔗种质材料进行遗传多样性分析,发现8对SSR引物共扩增出101个片段,其中多态性片段为93个,多态性比率为92.1%。聚类分析结果表明,参试材料间的遗传相似性系数为0.521~0.871,在相似性系数为0.614处,所有参试材料可分为两大类,3份国外种质材料PINDAR、CP72-1210、CP84-1198与ROC20、GT69-156聚为一类;而ROC26、GT02-237和GT97-69聚为另一类。【结论】基于CGE技术的SSR-PCR反应体系检测结果稳定,重复性好,适用于甘蔗的遗传分析及遗传作图。