应用果蝇胚胎细胞表达系统分泌表达猪干扰素α的试验

干扰素作为一类具有多种生物学功能的细胞因子,已经在人类疾病的防治中得到广泛应用.在兽药行业,大量的临床试验证明了干扰素激活免疫系统快速、广谱的有效性,但干扰素蛋白的活性和使用成本一直是制约其在兽药中应用的重要因素.为了探索人工重组的干扰素在兽医临床上应用的可行性,本文应用果蝇胚胎细胞表达系统筛选出了稳定表达猪干扰素α(rPIFNα)的细胞系,利用Western blot分析了细胞筛选前后的分泌蛋白的表达情况.结果显示,稳定表达细胞系的rPIFNα表达量较高,通过细胞试验证实,分泌表达的rPIFNα具有较强的抗病毒作用.本研究首次利用果蝇胚胎表达系统稳定表达猪干扰素,对干扰素在临床上应用是一个有益的尝试.     

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。     

猪干扰素α-1基因的原核表达与多克隆抗体制备

[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。     

鸡α-干扰素研究进展

自人类发现干扰素以来,研究者对于人类、哺乳动物及啮齿类动物干扰素进行了大量研究,取得了突破性进展。但是,以鸡干扰素为代表的禽类干扰素研究相对滞后。本文对鸡α-干扰素的结构、鸡α-干扰素的抗病毒作用以及基因工程鸡α-干扰素的应用等方面对鸡α-干扰素的研究现状作一综述。     

猪α干扰素基因突变、表达及其高效抗病毒活性筛选研究

利用RT-PCR方法从猪肝细胞总RNA中扩增出编码猪α干扰素基因,根据大肠杆菌偏嗜性及活性位点改造基因并克隆至原核表达载体p ET21a,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定。重组蛋白以包涵体形式表达,经变-复性及纯化处理后,获得多种不同基因型的高纯度猪α干扰素。用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明经过基因改造的猪α干扰素(Po IFN-M6)具有更高抗病毒活性,约为2.97×108U/mg。本研究为猪α干扰素基因工程产品的研发及其在临床兽医的应用奠定基础。     

重组鸡α-干扰素的表达及其生物活性的初步研究

为获得重组鸡α-干扰素并对其进行生物活性研究,本试验对重组大肠杆菌进行诱导表达,收集重组鸡α-干扰素包涵体后进行复性纯化及免疫印迹试验,并通过测定病毒EID₅₀,在接种H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的鸡胚中进行干扰素抗病毒活性试验,运用微变量细胞病变抑制法进行重组鸡α-干扰素抗病毒效价的测定。结果显示复性后重组鸡α-干扰素的免疫印迹试验成功获得了预期条带,在鸡胚中重组鸡α-干扰素具有显著的抗H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等活性作用。在CEF/VSV细胞系上测定重组鸡α-干扰素的抗病毒效价为1.5×2¹⁰ U/mg左右,高浓度重组鸡α-干扰素具有一定的细胞毒性。结果表明重组鸡α-干扰素蛋白具有免疫原性和抗原性,在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果,呈广谱性,抗病毒效价较高,为下一步抗病毒制品的创制奠定基础。     

重组猪IFN-α原核表达及其活性分析

为了表达猪重组α干扰素(rIFN-α)并对它的生物学特性进行研究,本研究采用RT-PCR从猪脾淋巴细胞中扩增出猪IFN-α基因,以pPROExHTa为载体构建了表达重组质粒polFN-α,转化宿主菌BL21,经IPTG诱导猪rIFN-α获得了表达,其分子量约22 ku.该重组蛋白以包涵体形式存在,其表达量占总菌体蛋白7%.粟用Ni-Ni金属螯合亲和层析方法纯化,其纯度达到80%以上,包涵体经复性后,在WISH/VSV系统上,采用细胞病变抑制法测定表明,其稀释度在小于1:103时才有抗病毒活性.本实验表达的猪rIFN-α具有一定的抗病毒活性,为研究具有广谱抗病毒效应的猪干扰素具有重要意义.     

干扰素在猪白细胞中的组成型表达

用流式细胞术可检测出SPF猪外周血单核细胞中的α-干扰素和γ-干扰素阳性细胞,在一些感染、未感染猪繁殖与呼吸综合征猪及阴性猪中也可检测到γ-干扰素阳性细胞。γ-干扰素阳性细胞分为单核细胞和浆细胞样树突细胞。通过Western blotting可以检测外周血单核细胞中有无α-干扰素的表达;通过免疫沉淀反应可在健康SPF猪外周血单核细胞中检测到大小为32和55～57ku的α-干扰素条带;样品中同样可检测到γ-干扰素,细胞因子呈大小为24、37、54ku的条带。细胞内干扰素的巨大作用可能是由于齐聚反应形成的,与之前对人α-干扰素的描述相像。猪细胞内α-干扰素在牛肾细胞系细胞上表现出预期的抗病毒活性。结果表明,干扰素以其独特的分子特性在猪白细胞中呈组成型表达。     

重组奶牛干扰素-α基因的原核表达

从健康奶牛的血液中分离白细胞，用刺激物诱导白细胞产生干扰素，采用RT—PCR扩增干扰素-α基因，构建原核表达载体pQE30-IFNα，用IPTG诱导表达。得到重组的奶牛成熟干扰素-α基因全长498bp，构建的原核表达载体诱导6h后表达量较高，表达产物的分子量约为20kD，从而获得了表达奶牛干扰素-α的基因工程菌株。     

干扰素在猪白细胞中的组成型表达

用流式细胞术可检测出SPF猪外周血单核细胞中的α-干扰素和γ-干扰素阳性细胞。在一些感染、未感染猪繁殖与呼吸综合征猪及阴性猪中也可检测到γ-干扰素阳性细胞。γ-干扰素阳性细胞分为单核细胞和浆细胞样树突细胞。通过Western blotting可以检测外周血单核细胞中有无α-干扰素的表达。通过免疫沉淀反应可在健康SPF猪外周血单核细胞中检测到大小为32和55～57ku的α-干扰素条带。样品中同样可检测到γ-干扰素,细胞因子呈大小为24、37、54ku的条带。细胞内干扰素的巨大作用可能是由于齐聚反应形成的,与之前对人α-干扰素的描述相像。猪细胞内α-干扰素在牛肾细胞系细胞上表现出预期的抗病毒活性。结果表明,干扰素以其独特的分子特性在猪白细胞中呈组成型表达。     

重组牛α-干扰素的原核表达与纯化

为在大肠杆菌表达系统中高效表达牛α-干扰素(bovine interferon-α,Bo IFN-α),将经密码子优化后的牛α-干扰素成熟蛋白基因合成并克隆到表达载体p Cold II中,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得可溶性的表达蛋白。对重组菌表达条件进行优化,结果显示在IPTG浓度为0.64 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为9 h的条件下,可溶性目的蛋白的表达量最高。重组蛋白经镍柱纯化后的纯度为99.2%,表达量为36 mg/L菌液。重组蛋白在MDBK细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1×106U/mg。     

重组猪干扰素α的原核表达及抗病毒活性

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性,利用pET-32a载体系统,构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外,MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性,并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性,同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平;之后通过小鼠攻毒保护试验,测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量,ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化,并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示,成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×10⁶ IU,对细胞没有损害作用,且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平;在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖,减少促炎因子的产生,延缓临床症状的出现。结果表明,原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性,为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。     

新兴猪γ-干扰素基因克隆及其真核表达质粒的构建

为研发猪γ-干扰素(interferon-gam-ma,IFN-γ)制剂,根据已发表的猪IFN-γ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR技术从3周龄新兴猪脾细胞中扩增出约500 bp的基因片段;将其片段连接到pMD18-T载体,经PCR、酶切及序列测定表明,该基因片段由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸,与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。新兴猪IFN-γ基因的成功克隆及真核表达质粒的构建,将为进一步研发猪干扰素制剂奠定了基础。     

猪干扰素α的原核可溶性表达及抗PEDV活性

旨在利用原核表达系统高效表达具有抗病毒活性的可溶性重组猪干扰素α(soluble recombinant porcine interferon-α,srPoIFN-α)。通过PCR方法扩增姜曲海猪IFNα基因成熟肽序列,将其分别克隆至原核表达载体pCold-Ⅱ、pET22b、pET30a和pET30a-ELP中并在大肠杆菌中进行表达;通过Western blot结合Image J软件或BCA定量分析不同表达载体、密码子偏好优化、培养基类别、纯化方式等因素对猪干扰素α基因在大肠杆菌中可溶性表达的影响,鉴定提高srPoIFN-α表达的有利因素;利用VSV-GFP和PEDV检测srPoIFN-α的抗病毒活性。结果显示,原核表达载体pET30a、密码子优化、HB-PET自诱导培养基和磁珠纯化均能显著提高srPoIFN-α产量(P<0.001);srPoIFN-α有效抑制VSV-GFP复制的稀释倍数为2^-8.1,与重组人干扰素α2b标准品的比活为1.71×10⁸ IU/g,有效抑制PEDV复制的稀释倍数为2^-10.29,抗P...     

猪α-干扰素基因在大肠杆菌中的表达及活性测定

根据GenBank中登录号为M28623的基因序列,合成猪α-干扰素成熟肽基因,并将该基因克隆至pQE-31载体,转化宿主菌M15诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明该蛋白以包涵体形式表达,分子量约21 ku,经包涵体变性复性后获得了具有抗病毒活性的干扰素,用MDBK-VSV系统检测其抗病毒活性不低于1010 U/0.1 mL.     

猪干扰素-δ基因原核表达载体的构建及高效表达

干扰素(interferon,IFN)因具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节作用而备受关注。本研究根据GenBank上公布的猪IFN-δ核苷酸序列设计1对引物,通过PCR方法扩增出猪 IFN-δ基因,片段大小为513 bp,并将其克隆到原核表达载体上得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta BL21(DE3)受体菌,经SDS-PAGE电泳分析,结果表明,pET-30a-DsbA-IFN-δ表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约20 ku,且主要以包涵体形成存在,经Western blotting分析发现表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。     

鸡α干扰素基因的原核表达及其活性测定

应用RT-PCR技术,从被刺激诱导的鸡脾脏淋巴细胞中扩增鸡α-干扰素(ChIFN-α)基因cDNA,经克隆和测序后,构建原核表达重组质粒pGEX-proChIFN-α(全长序列)和pET-ChIFN-α(不含信号肽序列),并分别转化相应的表达菌.重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,ChIFN-α基因均获得表达,重组蛋白大小分别为45 ku、26ku左右,表达的蛋白以包涵体形式存在.表达产物经变性、提纯、复性,重组蛋白的含量约为1 mg/mL.复性后的ChIFN-α能够在鸡胚成纤维细胞上抑制H5N1禽流感病毒的复制;用水泡性口炎病毒检测结果表明,重组ChIFN-α具有较高的抗病毒作用,其生物学活性达到2×106 u/mg.     

猪β-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

为了高效表达分泌型的猪β-干扰素,将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因(mPoIFNβ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC9K,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNβ。将以SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化学方法(LiCl),与鲑鱼精DNA(ssDNA)共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后获得阳性菌株,再经高浓度G418筛选到多拷贝菌株。以1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明:表达产物为22 ku和26 ku的混合物,在GS115中的表达量约为80 mg/L,占分泌型总蛋白的29.4%~30.8%,表明猪β-干扰素基因在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性的抗猪β-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。以细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素抗病毒活性,在MDBK(牛肾细胞系)中表达的猪β-干扰素的抗VSV比活性达到2.0×106U/mg;对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。     

猪干扰素α2亚型的表达纯化及抗病毒活性测定

为研究重组猪干扰素α2亚型(porcine interferonα2, poIFN-α2)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的抑制作用,试验构建了pCSMH-poIFN-α2的大肠杆菌表达载体,采用温度诱导poIFN-α2表达后,收集包涵体并复性后,采用亲和层析的方法对poIFN-α2进行纯化。采用Western blot方法检测纯化后蛋白的特异性,结果显示该蛋白具有较好的特异性和反应原性。用不同浓度的重组poIFN-α2处理MARC-145和PAM细胞24 h后,接种PRRSV(1 000 TCID₅₀)。24 h后收集细胞,采用荧光定量PCR检测细胞内PRRSV ORF7的核酸水平,同时检测细胞上清液中PRRSV的TCID₅₀。结果证明大肠杆菌表达的重组poIFN-α2可以有效抑制PRRSV的增殖。进一步检测重组poIFN-α2在PAM细胞上诱导干扰素刺激基因(ISG)的水平,结果证明重组poIFN-α2可有效诱导PAM细胞内IS...     

基于天然poIFN-α17突变的高活性猪干扰素α17m的制备及其体外抗病毒活性

为获得高抗病毒活性的猪α亚型干扰素(porcine interferon α,poIFN-α),将天然的poIFN-α17进行突变和合成,并将突变后的猪poIFN-α17基因命名为poIFN-α17m,合成poIFN-α17和poIFN-α17m基因后将其克隆入pVB220大肠杆菌表达载体,将该载体转化DH5α感受态细胞,进行温度诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE。将表达的蛋白采用Ni琼脂糖凝胶纯化后,采用Western blot检测重组poIFN-α17和poIFN-α17m的反应原性,在PK-15细胞上检测其对VSV和PRV的抗病毒活性,检测重组poIFN-α17和poIFN-α17m蛋白对下游干扰素刺激基因(interferon stimulating genes, ISGs)Mx1、OAS1、ISG15的诱导激活作用。结果显示,成功构建了pVB220-IFN-α17和pVB220-IFN-α17m表达载体,实现了poIFN-α17和poIFN-α17m在大肠杆菌中的表达。该蛋白具有良好的反应原性,且重组poIFN-α17m在PK-15细胞上对水泡性口炎病毒(vesicul...