兔抗犬细小病毒2a型多克隆抗体交叉保护研究

为探究犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）血清型只有一种的条件下,常用疫苗CPV-2型和CPV-2a病毒免疫血清抗体对国内流行CPV-2a病毒的中和率,试验将藏獒源CPV-2a毒株（10⁵ TCID₅₀/100 μL）和CPV-2（10^4.5 TCID₅₀/100 μL）疫苗接于F81细胞增殖,PEG6000法浓缩制成免疫原,各免疫新西兰长白兔3只,间隔2周1次,共免疫4次。收集血清纯化制备多克隆抗体,通过血凝抑制试验（HI）和血清中和试验（SN）分别用2种抗体中和CPV-2、CPV-2a病毒,对两者保护率进行初步评价,并对本地感染CPV-2a的4只犬,每组2只进行治疗,每日跟踪白细胞消长规律。结果显示,CPV-2a多抗中和国内流行病毒CPV-2a的HI抗体、中和抗体水平都极显著高于CPV-2多抗（P<0.01）,而中和CPV-2病毒的HI抗体、中和抗体水平两者差异不显著（P>0.05）,CPV-2a多抗组治疗能较快恢复正常值,2组白细胞数有显著差异（P＜0.05）。结果表明,CPV-2a多抗与常用CPV-2型疫苗免疫抗体相比能高滴度的中和CPV-2a,更适用于中国犬细小病毒的防制,对研发新型生物制品有一定意义。     

犬细小病毒基因疫苗单克隆抗体的制备

为获得可用于犬细小病毒(CPV)感染的治疗和快速诊断的单克隆抗体,从病料中分离了1株犬细小病毒,经PCR扩增VP1全基因并进行序列分析,确定为CPV-2 a型。再将VP1基因克隆到真核表达质粒pc DNA3中,构建了基因疫苗pc DNA3-VP1。用该基因疫苗免疫BALB/c小鼠3次后,取抗体效价高的两只小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA检测,结果获得了3株杂交瘤细胞株,该3株单抗与犬、猫细小病毒能发生反应,均不与犬瘟热病毒、流感病毒和犬腺病毒发生反应,诱生的腹水可体外中和犬细小病毒,其中两株单抗的中和效价为1∶256,1株单抗腹水的中和效价低于1∶128。结果表明,该CPV VP1基因疫苗可制备具有一定中和效价的CPV单克隆抗体。     

以免疫纳米微球为凝集原的犬细小病毒2型抗体凝集检测方法的建立

为建立以红色聚苯乙烯纳米微球为载体的犬细小病毒(CPV)抗体检测的间接凝集方法,本研究表达纯化了CPV-2VP2截短的重组蛋白rsVP2,并以rsVP2为致敏原与纳米微球偶联制备了免疫彩色纳米微球;通过对反应条件的优化,建立了一种快速检测CPV-2抗体的间接凝集方法。特异性试验结果显示,致敏微球仅与CPV-2阳性血清发生凝集反应,不与犬瘟热病毒、狂犬病病毒和犬腺病毒的阳性血清发生凝聚反应,特异性强;该凝集方法检测血清中和抗体的最低效价为1∶256;同一批次制备的3份致敏微球、3个不同批次制备的致敏微球以及4℃保存90d的致敏微球与CPV-2阳性血清的凝集反应特异性一致,凝集程度无明显差异,重复性稳定性均较好。该间接凝集检测方法对40份血清样品的检测结果与ImmunoComb■ Canine VacciCheck试剂盒(Dot-ELISA)检测结果的阳性符合率为97%。本研究建立的间接凝集方法为幼犬CPV-2母源抗体或免疫犬CPV-2抗体检测提供了一种快速、简便、准确、经济的方法。     

驴源抗犬细小病毒IgG抗体的制备及其抗病毒活性的分析

为制备驴源抗犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)抗体,首先利用F81猫肾细胞扩增CPV-2a病毒株,经甲醛灭活和氢氧化铝胶乳化,制成CPV灭活疫苗,病毒滴度为10-8.5 TICD50,然后通过肌肉分点注射免疫驴,连续免疫3次(第1次注射3mL,后2次各注射6mL),每次免疫前采血,分析驴血清的抗体滴度和中和抗体效价;利用盐析法和离子交换层析法分离和纯化驴血清IgG。用IgG处理幼犬(50mg/kg),用CPV-2a毒株对IgG处理的犬进行攻毒,分析IgG抗CPV的活性。结果显示,免疫3次后驴血清的CPV抗体滴度为1∶8 192,中和抗体效价为28.5。用制备的IgG处理幼犬未发现不良反应,经CPV-2a攻毒实验证实IgG处理犬的发病率和死亡率分别为33%,0%,均明显低于非处理组(分别为100%,83%),说明制备的驴源IgG具有明显的抗CPV活性。     

山羊抗犬瘟热-细小病毒二联高免血清的研制

采用犬瘟热-细小病毒二联活苗结合它们的强毒组织灭活苗,经不同途径交替免疫成年山羊4次后,抗犬瘟热病毒血清中和抗体效价可达1:1024,抗犬细小病毒血凝抑制(HI)效价达1:2048。用该血清制剂对临床感染犬瘟热和病毒性肠炎的犬、貉、狐336余病例进行跟踪治疗,总有效率可达85％,治愈率为68％。本血清具有安全性好、特异性强、治疗效果可靠等优点。     

一株新分离犬细小病毒灭活疫苗的制备及免疫效果研究

JL0911株犬细小病毒是由军事兽医研究所流行病与病毒病防控技术实验室分离得到的一株新型犬细小病毒,其主要抗原位点上的氨基酸序列较国内先前分离到的其他株有较大差异,不能被归入目前已有的CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c三个类型。本研究旨在利用JL0911株犬细小病毒研制灭活疫苗,并评价其免疫原性。试验采用10^5.5 TCID₅₀/mL的犬细小病毒JL0911,以甲醛灭活后,加入1/4体积的纳米佐剂,制备了犬细小病毒灭活疫苗。取1.5 mL上述疫苗,通过肌肉注射免疫普通家犬,免疫前后不同时间均采集血清,在F81细胞系上测定犬细小病毒的中和抗体。结果显示,免疫后14 d,试验犬血中细小病毒中和抗体效价较免疫前有显著提高,最高可由0提高至2⁹,表明本试验分离的JL0911株犬细小病毒具有生产犬细小病毒灭活疫苗的潜在价值。     

犬细小病毒CPV-QD12株的分离鉴定与序列分析

本试验成功分离了1株犬细小病毒,采用PCR、理化特性检验、HA及HI等方法对其进行了鉴定,并对其编码区全基因序列进行了分析。取临床患出血性肠炎幼犬粪便经无菌处理后同步接种F81猫肾细胞分离病毒,盲传至第4代开始出现典型的细胞病变。该病毒可凝集猪的红细胞,血凝效价为28,可被犬细小病毒单克隆抗体特异性中和而产生血凝抑制现象;病毒效价为105.5TCID50/m L;毒株对氯仿和胰酶不敏感,且耐酸耐热。经病毒理化特性试验及犬细小病毒单克隆抗体的血凝抑制鉴定其为犬细小病毒,通过PCR检测及编码区全基因的扩增、测序和序列比较,证实所分离毒株为CPV-2a亚型,并将其命名为CPV-QD12株,与2013年分离自中国江苏省的CPV-2a型犬细小毒株CPV-JS2及2011年分离自中国广西的CPV-2a型毒株CPV-JQ686671.1的编码区核苷酸相似性为99.6%,具有较近的亲缘关系。该研究可为诊断和防控犬细小病毒病提供参考。     

犬细小病毒2型变异株对高母源抗体犬的致病性

为了探究CPV-2变异株的致病性,用CPV-2a和CPV-2b野毒株,分别攻击犬细小病毒(CPV-2)高母源抗体(MDA)幼犬,根据犬临床症状,组织病理学,粪便排毒和血清抗体应答等指标,评价高母源抗体(HI滴度≥1∶160)对不同CPV病毒变异株的保护作用。结果表明, CPV-2a和CPV-2b攻毒后引起明显临床症状,攻毒后3～6 d粪便中CPV排毒。感染犬的组织样品经PCR检测表明,CPV-2a/2b病毒广泛分布。组织病理学分析表明,CPV-2a/2b感染引起肠道黏膜出血。研究表明,CPV-2高母源抗体对CPV-2a/2b变异株攻击不能提供有效保护,有必要开发CPV变异株的新型疫苗。     

肉食兽细小病毒阳性血清的制备与应用

为了研制用于检验肉食兽细小病毒相关制品的阳性血清，试验采用猫细小病毒(FPV)-A株对健康易感狐狸进行基础免疫，再用具有致病性的水貂肠炎病毒(MEV)-ZJ1株攻毒免疫的狐狸进行加强免疫，攻毒后第14天无菌采集血液，分离血清，并参照《中华人民共和国兽药典》中的方法对该血清进行细菌、支原体和外源病毒检验及中和抗体效价测定。通过观察细胞病变情况和进行免疫荧光检测测定中和指数，并用阳性血清对3个不同批次的水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联活疫苗进行外源病毒检验和鉴别检验。结果表明：所制备的血清无细菌、支原体和外源病毒污染。对不同动物来源的肉食兽细小病毒均具有良好的中和作用，中和抗体效价为1∶2 330。对不同动物来源的肉食兽细小病毒的中和指数均大于1×10^4.7。3个批次的水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联活疫苗顺利通过复合检验。说明试验制备的阳性血清能够用于肉食兽细小病毒相关生物制品的外源病毒检验和鉴别检验。     

犬细小病毒细胞毒蜂胶佐剂灭活抗原对山羊的免疫效果研究

应用犬细小病毒(CPV)细胞毒,F81细胞系传代培养增殖病毒,以该细胞毒液经甲醛灭活后制备成蜂胶佐剂灭活抗原,用以免疫山羊,观察其免疫效果.结果显示,以5mL/只恒定剂量接种山羊,经4次连续免疫后CPV抗体水平整体较低,第28天测定HI效价在27(1∶3128),而以5mL/只递增剂量4次连续免疫山羊后,抗体水平整体较高,第28天测定,抗体HI效价在29(1∶512),较恒定剂量免疫组高2个滴度水平.结果表明,采用犬细小病毒细胞毒蜂胶佐剂灭活抗原高免山羊可获得高效价的特异性抗血清.