猪传染性胃肠炎病毒吉林株的分离鉴定及S基因的克隆与序列分析

利用PK-15细胞从临床上表现为腹泻症状的病死仔猪肠系膜淋巴结材料中分离获得1株病毒,对该病毒进行病毒形态学、PCR检测与动物回归试验等系统鉴定后,证实该分离株为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),命名为TGEVJL。利用PCR方法克隆出其S基因部分片段,并将该基因序列和推导的氨基酸序列与7个不同来源的TGEV毒株进行同源性和亲缘关系的比较分析,结果表明,各毒株间核苷酸和氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和94.8%～98.8%;系统进化树结果表明,TGEVJL株与日本分离的TQ14毒株和西班牙分离的TOY56-165毒株亲缘较近,表明不同地区分离毒株的S基因差异不大。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因5′端部分片段克隆及序列分析

本研究扩增出猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) TH- 98株 S基因 5′端 6 72 bp片段 (TS1) ,包括 B、C两个主要抗原位点。将该片段克隆到 p MD 18- T载体上 ,经鉴定 TS1片段正确插入 p MD 18- T载体上。序列测定和分析表明 ,该片段的核酸序列与国外 TGEV毒株 Miller,Purdue15 ,FS772 /70等有很高的同源性 ,达 96 .88%以上 ,氨基酸同源性为 95 .0 9%以上 ,抗原位点 C(S蛋白第 4 8位氨基酸 )的丝氨酸变为脯氨酸。本研究首次克隆国内分离株 TH- 98株 S基因含有抗原位点 B、C且在 PRCV中缺失的片段。为进一步揭示 TGEV强弱毒株差别的分子机制和分子诊断的研究奠定了重要基础。     

猪传染性胃肠炎病毒南京株纤突S蛋白基因的克隆与序列分析

参考 Genbank收录的 TGEV- Miller株的基因序列 ,自行设计合成 1对引物 (TGEVP5 /P6 ) ,对不同代次的 TGEV疫苗弱毒 STC3及种毒 、种毒 进行了 RT- PCR扩增 ,产物经琼脂糖凝胶电泳分析 ,均出现 1条大约 12 6 2 bp的目的条带 ,经 Eco R 酶切 ,都产生了 871bp和391bp左右的两个片段 ,与预期大小相符。将种毒 RT- PCR扩增目的条带回收纯化后克隆入PMD18- T载体中 ,转化宿主菌 DH5 α,挑选阳性克隆 (命名为 PTs) ,提取重组质粒 ,用 Hpa 、Eco R 对重组质粒进行酶切鉴定以及 PCR扩增 ,然后进行序列测定 ,并进行了序列分析 ,证实与国外标准毒株 Miller、Fs772 / 70、Purdue、TO14等有较高的同源性     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段克隆序列分析及原核表达

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白可诱导中和抗体，是主要保护性抗原，N端抗原位点B和C在猪呼吸道冠状病毒(PRCV)中缺失。体外扩增TGEVS基因B、C抗原位点357bp片段(TS)。核苷酸序列与氨基酸同源性分析表明该片段较为保守。将TS克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌中。经IPTG诱导后，SDS—PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST，大小约为26ku)融合后大小约为40ku，目的蛋白分子量约为13．2ku，优化表达条件后表达量达37．9％。     

猪传染性胃肠炎病毒河北分离株核衣壳N蛋白基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR技术扩增了TGEV河北分离株的N基因,长度约为1 149 bp. 将该基因片段进行亚克隆重组到pMD18-T质粒载体上,连接转化,鉴定后得到阳性重组质粒pTN.对重组质粒插入的目的基因片段进行序列分析和比较,结果表明TGEV河北分离株N基因与国外的Purdue-115、FS772/70、TO14、96-1933株有≥95%的同源性;推导的氨基酸序列同源性≥95%.TGEV N基因的克隆及序列分析,为其蛋白质的表达分析提供了重要依据,也为进一步讨论该病毒的分子生物学特性奠定了理论基础.     

猪传染性胃肠炎病毒国内分离株S基因克隆及与国外分离株的同源性比较

用猪睾丸细胞增殖并扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）国内分离株TH－98，根据基因库中已发表的TGEV S基因cDNA序列，利用Oligo软件设计并合成2对引物，进行逆转录聚合酶合酶链反应（RT－PCR），扩增出2.3kb和2.1kb2个片段，即Sa与Sb。将Sa与Sb先后插入到pUC18质粒载体上的EcoRⅠ和PstⅠ多克隆位点上，构建了重组质粒pUC-S，根据TGEV S基因位点和pUC18的物理图谱，用相应的限制性内切酶进行酶进行酶切及套式PCR方法鉴定，分析，证明克隆的pUC-S为TGEV S基因，同时对pUC-S进行序列测定分析，并与来自美国，英国和日本的5个毒株进行核苷酸及编码氨基酸同源性比较，证明了S基因的高度保守性。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-1株的分离与基因7的克隆分析

从四川某猪场采集疑似病例的腹泻粪样中分离到1株病毒,该病毒经过ST细胞传代培养盲传至第4代时出现病变。通过荧光抗体染色、病毒中和试验、TCID50试验、核酸类型鉴定,结合样品正染后在电镜下的观察结果,确定该毒株为猪传染性胃肠炎病毒,命名为TGEV SC-1株。参照GenBank中收录的TGEV基因7的序列设计了1对特异性引物,以SC-1株的细胞增殖毒的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得了大小约为303 bp的基因片段,包括完整的基因7序列片段（237 bp）,在GenBank上的登录号为DQ437507。核苷酸和推导的氨基酸序列比较分析结果表明,该毒株与其他毒株的同源性均在92.4%以上,TGEV SC-1株与美国的PURDUE和中国的TH-98毒株亲缘关系最近;与日本各分离毒株、中国TS株、美国Miller株、中国台湾TFI株和英国96-1933株的同源性较低。TGEV基因7在密码子使用的选择上,存在较大的偏向性;基因7编码蛋白在两端存在有明显的疏水性区域,在2～24和56～75位氨基酸残基处存在跨膜结构。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因的克隆与同源性比较

用猪睾丸 (Swine testicle,ST)细胞繁殖并扩增猪传染性胃肠炎病毒国内分离株 TH- 98,根据 Gen Bank中已发表的TGEV S基因 c DNA序列 ,利用 Oligo4.1程序软件设计并合成两对引物 ,进行逆转录聚合酶链式反应 (RT- PCR) ,扩增出2 .3kb和 2 .1kb两个片段 ,分别命名为 Sa与 Sb,先后插入到 p UC18质粒载体上的 Eco RI和 Pst I多克隆位点上 ,构建了重组质粒 p UC- S。根据 TGEV S基因位点和 p UC18的物理图谱 ,用相应的限制性内切酶进行酶切及套式 PCR方法进行鉴定、分析 ,证明克隆的 p UC- S为 TGEV S基因。同时对 p U C- S进行序列测定分析 ,并与来自美国、英国和日本的五个毒株进行核苷酸及编码氨基酸同源性比较 ,证明了 S基因的高度保守性     

猪传染性胃肠炎病毒SCY株3′端8．5kb片段的克隆及序列特征分析

根据GenBank的核酸序列，设计6对引物自TGEV SCY株中分别扩增了长为1．5kb、2．0kb、1．1kb、1．4kb、1．4kb、1．3kb的6个片段，经克隆测序拼接后获得8495bp的TGEV部分序列。根据与其他TGEV和冠状病毒的序列和结构特征比较表明，该段序列克隆了除TGEV聚合酶基因以外的S、M、N、E、NSP3a、NSP3b、ORF7共7个基因的核酸序列；根据S、M、N基因的序列构建了系统进化树，分析表明TGEV-SCY株与TS、HN2002、TO14、pudue等毒株亲缘关系较近；密码子偏爱性分析结果认为TGEV在对密码子的使用上存在轻微的偏向性，个别氨基酸偏向于选择以A和T结尾的密码子。     

猪传染性胃肠炎病毒陕西株的分离鉴定

从陕西省某猪场临床上表现为腹泻症状的病死仔猪肠道内容物及粪便材料中分离获得1株病毒,采用PK-15细胞培养、理化试验及中和试验鉴定后,证实该分离株为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV).克隆分离株N基因,并将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他不同来源的TGEV毒株进行比较分析.结果表明,分离株N基因与其他毒株核苷酸的同源性为94,3％～98.3％,氨基酸同源性为95.6％～99.4％.系统进化树结果表明,分离株与TGEV HN2002株(河南株)亲缘关系最近.     

猪传染性胃肠炎病毒S、N基因核酸疫苗的构建与免疫原性试验

采用RT-PCR扩增TGEV SC-H株S基因5′端主要抗原位点编码区和全长N基因,将其插入真核表达载体pVAX1,构建单独与嵌合表达S、N基因的pVAX-S、pVAX-N、pVAX-S-N 3种重组质粒。通过脂质体将重组质粒体外转染COS-7细胞,利用间接免疫荧光检测目的基因的表达情况。将6周龄NIH小鼠随机分为5组,分别于腿部肌肉注射重组质粒pVAX、pVAX-S、pVAX-S-N、pVAX-S+pVAX-N与pVAX-S+pVAX,共免疫3次,间隔2周。通过间接ELISA以及流式细胞仪分别检测免疫小鼠血清中特异性TGEV IgG抗体和外周血T淋巴细胞亚群数量。结果显示,重组质粒构建正确且在COS-7细胞中得以表达;pVAX-S+pVAX-N质粒混合免疫组与pVAX-S+pVAX质粒混合免疫对照组相比,可有效提高免疫小鼠外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,而pVAX-S-N免疫组与pVAX-S组比较,未能起到提高免疫小鼠血清中特异性抗体水平的和外周血T淋巴细胞亚群数量作用。以上结果表明S、N基因的联合应用可有效加强TGEV核酸疫苗的免疫效力,但这种增强作用与S、N基因联合应用的方式直接相...     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因重组腺病毒的构建及特性研究

将克隆的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）全长S基因插入pAdTrack—CMV穿梭质粒中，形成的转移质粒pAdTrack—CMV／S线性化后，用pAdEasy^TM系统电转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠埃希氏菌BJ5183，经同源重组，构建了含有全S基因的重组腺病毒载体，经酶切充分暴露反向末端重复序列后，与脂质体混合转染AD-293细胞，成功获得了AD-S复制缺陷型腺病毒，经检测证实，AD-S稳定性好，安全性高。转录水平检测证实，S基因得到了转录；荧光检测发现，外源蛋白已得到表达。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEVN基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法。应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1168bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株的序列同源性达到95%～97%;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的TGEV-N-cDNA;对猪传染性胃肠炎(TGE)的病料进行RT-PCR鉴定,可检测出TGEVN基因片段。结果表明建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查。     

伪狂犬病病毒Bartha-K61株UL49基因的克隆和序列分析

根据已经发表的伪狂犬病病毒(PRV)国内Ea株UL49基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区,并克隆到pMD18-T载体中.重组质粒pMD-UL49经XhoI酶切和PCR鉴定后,进行了序列测定和分析.结果表明,重组质粒pMD-UL49含有PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区.同源性分析显示,PRV Bartha-K61株UL49基因序列与国外Kaplan株、国内Ea株相应基因的核苷酸同源性分别为98.9 %和94.1 %,推导的氨基酸序列同源性分别为96.7 %和87.2 %.