紫椴ISSR-PCR反应体系的建立与优化

分别采用单因子试验和正交设计2种方法对影响紫椴ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2 ,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验.正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平.单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平.2种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了紫椴ISSR-PCR的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Taq酶1.0U,Mg2 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.20 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,1×PCR buffer,30 ng模板DNA.在此基础上筛选出14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.     

野扁桃ISSR-PCR反应体系的优化

以野扁桃为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的Mg2 、dNTPs、Taq酶、模板DNA、引物等因素进行筛选和优化,确立了适合野扁桃ISSR分析的最佳反应体系:25μL PCR反应体系中包含1×Buffer,2.0 mmol.L-1Mg2 ,160μmol.L-1dNTPs,模板DNA30 ng,Taq聚合酶1 U,引物15 pmol。     

油桐ISSR-PCR最佳反应体系的建立

在油桐遗传多样性研究中,为了获得清晰可靠、重复性强的ISSR扩增结果,综合采用单因子试验和正交设计两种方法对影响油桐ISSR-PCR反应结果的4个因素(Taq酶、Mg2 、dNTP、引物)进行优化试验.单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响,找出最佳反应水平.正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析获得影响因素最佳反应水平.通过综合比较分析,最终建立了油桐ISSR-PCR反应的最佳反应体系,即在20 μL反应体系中,Taq DNA聚合酶1.0 U,Mg2 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.20 mmol·L-1,引物0.4 μmol·L-1,1× PCR缓冲液,40 ng模板DNA.     

适用于厚朴的SRAP反应体系的建立与优化

利用正交试验L16(45),结合单因素试验对厚朴相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记反应体系的5个因素(Mg2+,dNTPs,引物,Taq酶和模板DNA)进行优化试验,结果表明:各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为:dNTPsTaq酶模板DNAMg2+引物;筛选出各反应因素的最佳水平,建立厚朴SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:Taq酶1.5 U,Mg2+1.8 mmol.L-1,模板DNA100 ng,dNTP 0.24 mmol.L-1,引物0.40μL。试验表明,该体系重复性好、稳定性强。     

萱草属植物ISSR-PCR反应体系的优化

以萱草属的3种植物为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的因素Taq酶用量、Mg2 浓度、dNTP用量、引物用量、模板DNA浓度以及退火温度等指标进行单因子筛选和优化,建立了适合萱草属植物ISSR-PCR分析的最佳PCR反应体系:20μL反应体系中Taq酶0.6U、Mg2 1.8 mmol/L、1×Buffer 2 μL、dNTP0.2 mmol/L、引物0.6mmol/L、DNA模板10 ng/μL.扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性40 s,52℃退火45 s,72℃延伸1.50 min,共39个循环;72℃完全延伸5 min,4℃保持.该反应体系及扩增程序扩增谱带清晰,产物量多,为利用ISSR-PCR分子标记研究萱草属植物的遗传多样性提供标准反应条件.     

云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应体系优化研究

采用交互正交设计L64(421)对濒危植物云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应体系分别进行了5因素(Taq酶;Mg2 ;dNTP;DNA及引物)4水平的优化筛选,SAS软件统计分析表明:3个单因素(Taq酶;Mg2 ;dNTP)和2个交互作用(Taq×Mg2 ,Mg2 ×dNTP)对此反应体系有显著影响作用.云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应的优化体系是:在20μL反应体系中含有1×PCR buffer,Taq酶4 U,Mg2 (2.0 mmol·L-1),dNTP(0.4 mmol·L-1),DNA 75 ng,引物(1.0 μmol·L-1),退火温度(54℃).交互正交设计既能快捷有效地筛选出最佳PCR反应体系,又能揭示试验因素及其交互作用对扩增的影响程度,分析结果更客观、准确,具有一定的应用价值.     

用正交设计法优化枣树ISSR-PCR反应体系

采用正交设计的方法对枣ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的浓度)在4水平上进行优化试验,PCR结果用DPS数据处理软件分析。实验结果表明:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Mg2+影响最大;筛选出了各反应因素的最佳水平,建立枣ISSR-PCR的最佳反应体系(25μL)为:Taq酶1.0 U、Mg2+1.0 mmol/L模板DNA 1.0μL、dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L。     

枫香ISSR-PCR扩增条件的优化

对浙江省天台山枫香自然种群的DNA进行提取和ISSR-PCR扩增条件的优化。分析了Mg2+浓度、4×dNTP浓度、BSA浓度、模板DNA用量、引物用量、Taq DNA聚合酶用量等对反应结果的影响。建立了适用于枫香ISSR分析最适宜的反应体系:10μl PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH值9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%TritonX-100),2.0 mmol.L-1Mg2+,0.15 mmol.L-14×dNTP,2 mg.mL-1BSA,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.9 U TaqDNA聚合酶,引物UBC808的最适退火温度为52.4℃。用此反应体系对天台山枫香自然种群进行了遗传多样性分析,结果显示其多态位点百分率为84.26%,Nei指数为0.2665,Shannon信息指数为0.4044,其遗传多样性处于较高水平。     

台湾水青冈ISSR-PCR体系的优化

分析了ISSR-PCR体系中Mg2+、dNTP和BSA浓度,以及模板DNA、引物和TaqDNA聚合酶用量等6个因素对反应结果的影响,建立了适合于台湾水青冈ISSR-PCR扩增的反应体系:10μL PCR反应液中,含10 ng DNA,1.5 mmol.L-1Mg2+,0.125 mmol.L-14×dNTP,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH值9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),0.6 UTaqDNA聚合酶,2 mg.mL-1BSA和3pmol引物。应用优化的ISSR-PCR体系从100个ISSR引物中筛选出12个稳定性好,重复性高的引物,对22株台湾水青冈个体的DNA进行扩增,结果表明优化的ISSR-PCR体系完全适合于台湾水青冈的ISSR分析。     

短柄ISSR-PCR反应体系的优化

以短柄(Quercus glanduliferavar.brevipetiolata)的DNA为材料,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如模板DNA用量、Taq酶的用量、镁离子浓度、dNTP的浓度、引物用量和牛血清白蛋白浓度等指标进行筛选和优化。结果显示适合短柄ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件为:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),0.75UTaq DNA聚合酶,2 mmol.L-1MgCl2,0.2 mmol.L-14×dNTP,12 pmol引物,10 ng模板DNA,2 mg.mL-1牛血清白蛋白。短柄ISSR扩增较适宜的退火温度为54.4℃。