Expression of High-molecular-weight Artificial Spider Dragline Silk Protein in Escherichia coli

依据已报道的蜘蛛（Nephila clavipes）牵丝蛋白部分cDNA序列，设计合成两种不同结构的拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体，大小分别为360和390 bp。多聚化得到8倍体和16倍体后，克隆到表达载体pET-30a，得到4种表达载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)诱导表达。用自制的抗蜘蛛牵丝蛋白血清Western blot检测，表达产物呈梯度排列，主带与预计大小一致。蜘蛛牵丝蛋白表达量最高为800 mg/L。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因的克隆与表达

蜘蛛丝具有极高的强度和韧度,工业和医学应用价值很高,但由于蜘蛛的不可驯养性使其应用受到限制。因此,本文尝试利用基因工程的方法获得蛛丝蛋白的表达。我们利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837bp的拖牵丝蛋白基因（ASP）,并分别将其构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,分别命名为pASG和pASN。pASG在大肠杆菌中16℃下24h诱导表达后,经蛋白质印迹证明成功地表达了GST-ASP融合蛋白;pASN转染昆虫sf9细胞48h后观察到了绿色荧光蛋白GFP的表达,表明ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中分别得到了正确表达。本研究为利用基因工程的方法开发蛛丝蛋白的生产途径提供了有益的尝试。     

耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA)工程菌的构建及其表达条件

从Bacillus sp.110-2基因组上分离得到的耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA),将其连接到原核表达载体pET-30a(+),得到重组载体pET-sodA,重组载体在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导得到表达.SDS-PAGE分析显示,融合表达产物的分子量大小为26.5 kD.对含有sodA基因工程菌的表达情况研究表明,重组蛋白全部以可溶性形式存在;重组酶的比活力252 U/mg,为原始菌株的2.1倍,目的基因在大肠杆菌中实现了高效表达;而且,重组酶还保留了野生型酶强的耐碱能力.BL21(pET-sodA)基因工程菌的构建提供了一种可利用的耐碱蛋白资源,同时探索了一种极端酶的生产方法.     

部分蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白基因的合成及其聚合体在大肠杆菌中的表达

已知蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白N端序列不完整，有大量多聚丙氨酸基序组成的重复区。根据已报道的金纺者（Nephila clavipes）相应基因序列，合成若干寡核苷酸链，通过PCR获得编码涵盖三组多聚丙氨酸基序的基因片断。并以此为单体，经过酶切和连接获得重复区分别为2、4、8拷贝的聚合体。序列及RNA二级结构比对显示：所获8聚体与已报道基因编码的氨基酸同源性高达84％，但8聚体基因mRNA具有较低能级。将上述3种聚合体基因分别克隆大肠杆菌（Escherichia coh）表达载体pET-30a（＋），经IPTG诱导、利福平阻断菌体基因表达及在培养基中添加^35S-Met，通过放射自显影可见由T7启动子引发的特异目的基因表达带。     

人Irisin基因的克隆、原核表达及重组蛋白的纯化

鸢尾素(Irisin)是新发现的一种肌肉因子,其前体是Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectin typeⅢdomain-containing protein 5,FNDCS).为实现人(Homo sapiens) Irisin的原核表达,通过反转录PCR得到人肌肉组织总RNA的cDNA,并以特异性引物扩增得到人FNDC5基因的cDNA序列.以特异性引物扩增将人Irisin基因序列引入NdeⅠ和Xho Ⅰ酶切位点,经双酶切后插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒并转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3) pLysS.通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)检测,用镍柱纯化目的蛋白,并用Western blot方法鉴定.DNA序列分析结果显示,克隆的人Irisin基因序列和NCBI公布的序列一致,并成功构建了pET-30a-Irisin重组表达载体;SDS-PAGE电泳检测和Western blot结果表明,表达蛋白分子量约为14kD,与预期大小一致;实现了人Irisin的可溶性表达,得到了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究人Irisin蛋白的结构、功能及应用提供了理论依据.     

耐碱锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）基因工程菌的构建及其表达条件研究

利用PCR技术以Bacillus sp.110-2基因组DNA为模板,扩增出606 bp编码锰超氧化物歧化酶的基因Mn-sodA,将其连接到原核表达载体pET-30a(+),得到重组载体pET-sodA,重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导得到表达。SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量大小为26.5k Da,同核酸序列测定的推导值相符。对含有sodA的基因工程菌表达情况研究表明：重组蛋白全部以可溶性形式存在;重组酶的比活力252 U/mg,为原始菌株的2.1倍,目的基因在大肠杆菌中实现了高效表达;而且,重组酶还保留了野生型酶显著的耐碱能力。BL21（pET-sodA）基因工程菌的构建一方面提供了一种可利用的耐碱蛋白资源,另一方面探索了一种极端酶的生产方法。     

适用于稻瘟病菌基因敲除、过表达和荧光融合蛋白表达载体的构建和使用

本研究意在提供一系列适于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的基因敲除、过表达和荧光蛋白融合表达,并且操作简单、耗时短、稳定可靠的通用载体,为系统研究稻瘟病菌的基因功能提供便利.通过PCR、克隆、酶切、连接等分子生物学方法,克隆了2个在菌丝和附着胞阶段都强力表达的启动子(SOD1启动子和H3启动子);构建了14种载体:3种稻瘟病菌基因敲除载体(pBS-SUR、pBS-BAR和pBS-NEO)、4种丝状真菌基因过表达载体(pKD5、pKD6、pKD61和pKD8)和7种丝状真菌荧光融合蛋白载体(pKD5-GFP、pKD5-RED、pKD6-GFP、pKD6-RED、pKD7-RED、pKD8-GFP和pKD8-RED);并提供了这些载体在丝状真菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达中的应用方法.使用构建的基因敲除载体通过原生质体及ATMT转化最多同时在稻瘟病菌中敲除了4个基因;用pKD5-RED、pKD6-GFP和pK)6-RED转化稻瘟病菌后,发现SOD1启动子和H3启动子控制下的绿色和红色荧光蛋白在稻瘟病菌中强力表达,Real-time PCR结果证实SOD1启动子指导下的eGFPmRNA表达量是β-tubulin的2.5倍,SOD1启动子指导下的DsRED2mRNA表达量是β-tubulin的5.4倍,而H3启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是β-tubulin的20.8倍;MoATG8-DsRED2的融合蛋白(使用pKD6 -RED)可以正确定位MoATG8于小泡附近;SOD1启动子驱动的DsRED2(使用pKD6-RED)可以在稻瘟病菌的菌丝、孢子、附着胞等各个发育阶段表达.这些实验说明14种载体可以用于稻瘟病菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达,也可用于镰刀菌等其他丝状真菌的基因功能研究.     

germin基因的克隆及其在烟草中的表达

摘要：克隆了具有草酸氧化酶活性的小麦(Triticum aestivum )Germin蛋白的基因，构建了植物表达载体并用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )介导法转化烟草。Southern杂交和酶活性检测表明，germin基因在转基因烟草(Nicotiana tabacum )中得到整合、表达，并正确组合成具有草酸氧化酶活性的同源六聚体蛋白。离体实验表明，外源germin基因的表达提高了转基因烟草离体叶片对草酸的耐受性。     

犬瘟热病毒磷蛋白的表达及抗体制备

犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)是一种急性高度接触性传染病病原,可引起犬(Canis)、猫(Felis)等多种属动物发热、腹泻、肺炎和中枢神经系统紊乱,其磷蛋白(phospho-protein,P)在病毒复制和致病中具有重要作用。本研究根据犬瘟热病毒P蛋白基因(GenBank No.AF164967)设计引物,RT-PCR扩增得到CDV-P基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-CDV-P,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株,异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组his-CDV-P蛋白,His-band纯化后获得高纯度重组蛋白,纯化蛋白免疫balb/c小鼠,制备了小鼠抗CDV-P抗体,检测CDV感染细胞内P蛋白的表达和细胞定位,检测不同感染时间细胞内P蛋白的表达。SDS-PAGE电泳结果表明,获得重组蛋白的分子量大小为65 kD,表达的蛋白以包涵体形式存在,占总菌体蛋白的35%以上,纯化后占总蛋白60%以上;Western blot检测表明,小鼠抗CDV-P抗体能特异性识别原核表达产物和病毒感染表达产物,CDV-P在感染细胞内具有两种表现形式(磷酸化和非磷酸化);间接免疫荧光结果显示,该蛋白在胞浆和胞核中都存在;CDV-P在病毒感染的早期和晚期都有表达,随着感染时间延长表达逐渐增加,并且其磷酸化水平也逐渐增加。本研究制备了重组P蛋白和多克隆抗体,检测了P蛋白在感染细胞内的表达和定位,为P蛋白功能和CDV致病机理研究提供基础资料。     

Expression of the Truncated vip3A Gene at the 3'-terminus from Bacillus thuringiensis in Escherichia coli

将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)缺失C端154个氨基酸编码区的vip3A基因(vip3T)插入原核表达载体pQE30，构建了重组表达载体pQEvip3T，并转化大肠杆菌(Escherichia coli ) M15进行IPTG诱导表达，比较了完整的Vip3A蛋白和C端缺失的蛋白Vip3T的可溶性和杀虫活性。与Vip3A不同，融合蛋白Vip3T以不可溶的包含体形式存在，诱导表达的菌液中没有检测到可溶性Vip3T蛋白。生物测定结果表明，M15(pOTP)诱导表达的Vip3A蛋白对初孵斜纹夜蛾(Spodoptera litua)和甜菜夜蛾(S. exigua)幼虫具有较高的杀虫活性，其提纯的包含体无毒，但包含体的碱性裂解液却又恢复了对夜蛾科害虫的活性；M15(pQEvip3T)菌液、包含体及其碱性裂解液对这两种昆虫幼虫则完全无毒，说明在大肠杆菌中，Vip3A蛋白C端氨基酸可能对Vip3A蛋白的可溶性和杀虫活性具有重要的影响。     

嗜水气单胞菌aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析

以自行分离的嗜水单胞菌分离株AHCS02为研究对象,分析其产生的aer毒素基因结构.根据GenBank中aer毒素的基因序列（M16495）,设计扩增编码aer毒素成熟蛋白基因的引物,以AHCS02的基因组DNA为模板,PCR扩增出长度为1 332 bp的核苷酸片段,进行pMD18-T载体克隆.酶切鉴定后进行序列测定和分析,结果表明扩增的片段与M16495的同源性达92%,将测得的序列登录GenBank数据库,所得的序列编号为AY136943.分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示：其编码443个氨基酸,为aer毒素成熟蛋白的基因,与M16495相比,氨基酸差异主要集中在422氨基酸残基至436氨基酸残基的位置上,在这个位置上共有8个氨基酸残基发生变化,其中在435和437氨基酸残基之间有一个氨基酸密码子丢失,氨基酸的同源性达95.5%.证明aer毒素基因的5＇端保守,3＇端变异较大.     

青花菜BoCHS2基因的克隆、表达和反义载体的构建

根据前期的研究结果设计PCR引物,从青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片基因组DNA和cDNA中克隆到了查尔酮合成酶基因,定名为BoCHS2.BoCHS2的基因组DNA全长为1267bp,具一个长度为85bp的内含子,基因编码区全长为1182bp,编码393个氨基酸.基因序列已提交至...     

鸡、猪BPI氨基端的基因克隆和鉴定

为了克隆杀菌/通透性增加蛋白(BP I)N端cDNA,构建重组体pM D 18-T-BP I,并进行序列鉴定,应用RT-PCR技术,参照G enB ank报道的预测序列,从鸡多形核白细胞(PM N)mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白(BP I)氨基端95个氨基酸的基因片段,并与pM D 18-T连接,构建BP I氨基端的基因重组体,进行酶切鉴定和序列测定;从猪PM N的总mRNA中扩增出BP I氨基端48个氨基酸的基因片段,进行测序鉴定。获得鸡BP I N端长度为285 bp的基因片段。序列分析证实该片段中有3个点突变,但均不在活性中心;获得猪BP IN端长度为146 bp的基因片段。成功克隆出BP I N端基因,经序列测定,确认为BP I基因,为进一步表达该基因奠定了基础。     

白沙蒿肌动蛋白基因核心片段的克隆和序列分析

本研究以荒漠植物白沙蒿总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增出肌动蛋白基因核心序列。将获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析表明：白沙蒿肌动蛋白基因核心片段长599bp,编码198个氨基酸。将该序列在GenBank中注册,并与多种植物肌动蛋白序列进行同源性比较,发现该片段的核酸序列同源性在75％以上,氨基酸序列同源性在85％以上,具有高度保守性。     

牛杀菌/通透性增加蛋白氮端片段的原核表达

目的 克隆牛杀菌/通透性增强蛋白(BPI)N端cDNA,构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达BPI蛋白,并纯化重组蛋白。方法 参照Genbank报道的序列,应用RT-PCR技术,从牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白基因,然后将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中,重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。结果 获得BPI N端长度为714 bp的基因片断,序列分析证实该片断中有1个点突变。大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量约为52×103的GST-BPI融合蛋白。结论 成功的表达和纯化了BPI重组蛋白。     

黄冠梨几丁质酶基因家族cDNA全长序列克隆与分析

根据已知植物几丁质酶基因序列的保守区域,设计特异性引物,以梨黄冠品种叶片为材料,提取RNA,进行反转录,克隆获得5个几丁质酶基因cDNA片段,进一步通过RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,依次命名为PyChi1、 PyChi2、 PyChi3、 PyChi4、 PyChi5,序列提交GenBanK,登录号为：FJ589783、 FJ589784、 FJ589785 、 FJ589786、FJ589787。序列分析结果表明,所获得5个几丁质酶基因,都具有完整的ORF和Poly(A)结构,与其他植物几丁质酶基因具有较高的相似性;5个基因的核酸序列的同源性约在35%~53%之间,PyChi1和PyChi4的氨基酸同源性最高,约85%,而与PyChi5约77%;在几丁质酶基因家族,分别属于Chitinase ClassesⅠ-Ⅴ,为5个不同类型的成员;不同类型的几丁质酶基因在核酸和氨基酸序列以及功能结构方面都存在着存在着显著的差异,主要表现在肽链特性和基因结构等方面。这为进一步研究梨几丁质酶的结构和功能奠定了基础。     

燕麦AsKUP1的克隆与功能分析

植物钾离子转运蛋白中的Na~+不敏感性KUP/HAK/KT转运蛋白对植物耐盐胁迫起着重要作用。为了阐明钾离子转运蛋白基因AsKUP1在燕麦中响应盐胁迫的表达模式和鉴定其生物学功能,从燕麦中克隆了AsKUP1,利用RACE方法获得AsKUP1全长序列,并对其进行生物信息学分析;构建了pCAMBIA1301-AsKUP1植物过表达载体,转化拟南芥,并运用实时荧光定量PCR方法分析AsKUP1在拟南芥中的表达情况。结果表明,AsKUP1全长2 951bp,包含2 334bp的ORF序列,预测编码777个氨基酸,等电点为8.55,分子量为87.0k D。序列分析表明,AsKUP1与山羊草和小麦KUP/HAK/KT家族亲缘关系较近,预测该蛋白有14个疏水跨膜结构域,位于细胞质膜的概率较大。此外,盐胁迫下,T2转基因种子萌发率为57%,野生型为43%;经潮霉素筛选分离比为3∶1的2个转基因株系后代T3转基因株系根长分别是野生型的1.46倍和1.34倍,T3转基因植株鲜重、干重分别是野生型的1.56倍和1.44倍,Na~+含量无显著差异,而K~+含量为野生型的1.25倍,说明AsKUP1的表达提高了拟南芥植株的耐盐性。本研究结果为揭示钾离子转运蛋白家族基因AsKUP1在植物中的耐盐机制和通过转基因技术提高植物耐盐能力奠定了基础。     

草鱼leptin基因的分离鉴定及在巴斯德毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术扩增出草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的leptin基因,将leptin基因克隆至真核表达载体pPIC9K,电穿孔转化GS115菌株,经G418筛选和甲醇诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE琼脂糖凝胶电泳和Westernblot分析。结果表明,草鱼leptin基因cDNA序列由438个核苷酸组成,编码146个氨基酸组成的多肽(GenBank登陆号AY551335),与鲤鱼(Cyprinuscarpio)leptin基因相比,核苷酸和氨基酸的同源性为99%;与人、猪和鼠相比,核苷酸同源性分别为84%、86%和95%,氯基酸的同源性分别为84%、82%和96%;与河豚(Takifugurubripes)相比,氨基酸具有较大的差异,仅有9%的同源性,表明leptin在物种的进化上具有一定的差异;实现了草鱼leptin基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)中的表达,表达蛋白的分子量约为16kD,Westernblot分析表明,表达产物具有一定的免疫学活性。