苹果茎痘病毒病原学研究初报

对从苹果上获得的苹果茎痘病毒的分离物ASPV—MX进行了研究 ,人工接种 4科 13种草本指示植物 ,发现ASPV—MV易由汁液摩擦接种 ,能侵染一种藜 (Chenopodiummurale)、西方烟 (Nicotianaoccidentalis - 37B)、西方烟亚种 (Nicotianaoccidentalissubsp‘obligua’)、鸡冠 (Celosiacristata)、千日红 (Gomphrenaglobosa) ,尤其在西方烟及西方烟亚种上症状明显 ,这 2个西方烟可以作为ASPV的鉴别寄主和繁殖寄主 ,在这 2种烟草的接种叶上均产生坏死枯斑 ,在西方烟的系统叶上主要产生明脉现象 ,而在西方烟亚种上的系统叶上产生线纹坏死。通过试验测得ASPV的致死温度为 6 2℃ ,稀释限点为 1× 10 -2 ,体外存活期为室温约 2 4h。     

苹果茎痘病毒RT-PCR检测及分子变异分析

利用RT-PCR技术对采自6个苹果品种和7个梨品种的33个样本中的苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 进行了检测, ASPV感染率为63% ( 19 /33) 。对6个ASPV中国分离物外壳蛋白(Coat protein, CP) 基因进行了扩增、克隆和测序, 测序结果显示CP基因全长为1 191 nt, 编码397个氨基酸。中国分离物与GenBank中其他分离物核苷酸序列同源性为70.2% ～91.7%。系统进化分析显示不同ASPV分离物分为3个大的类群, 呈现一定的寄主相关性, 并未呈现明显的地理相关性。第一和第三大类群的寄主皆为苹果, 第二大类群包含6个梨分离物和2个苹果分离物。不同ASPV分离物的抗原指数差异较大, 推断可能由于序列变异引起抗原表位变异, 从而引起血清型差异。     

苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus,ASPV）的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,根据ASPV外壳蛋白基因（coat protein,cp）保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品构建标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线决定系数达0.996,扩增效率为99%;该方法特异性好,与苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）均无交叉反应;其最低检测限为1.31 × 102 copies ? μL-1,灵敏度比常规RT-PCR高100倍;批内和批间变异系数均小于1.85%。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,适用于田间样品中ASPV的快速定量检测。     

砂梨上苹果茎痘病毒的调查分析及RT-PCR与TC-RT-PCR检测研究

试验通过西方烟(Nicotianaoccidentalis‘37B’)和杂种(Pyroniaveitchii)、A20接种鉴定及PAS-ELISA检测,对保存于国家砂梨种质资源圃的38份砂梨样品进行了苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus,ASPV)带毒率的调查分折。结果表明,生物学鉴定与血清学检测结果一致,ASPV带毒率均为26.3%。应用以dsRNA为模板RT-PCR检测该病毒,在杂种和A20上显症的6个样品均获得316bp目标片段。应用TC-RT-PCR检测显症的西方烟,也获得了预期的目标片段。     

苹果和梨树培养茎尖抑制生长保存试验

苹果品种‘富士'、梨品种‘R54'培养茎尖分别植入12种保存培养基中,在10、5、1℃无光照条件下保存,以筛选保存培养基和保存温度。结果表明,‘富士'培养茎尖在保存培养基为MS(无NH_4)+0.5 mg/L 6-BA,保存温度为1℃条件下,保存4年生存率为100%。‘R54'培养茎尖在保存培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA、1/4MS+0.5 mg/L 6-BA+1/4蔗糖、1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+1/2蔗糖,保存温度为5℃条件下,保存4年生存率为100%。     

苹果优良矮砧S18,S20微茎尖脱毒组织培养技术研究

通过对武乡海棠优良矮砧Ｓ１８、Ｓ２０两个单系的０．２ｍｍ微茎尖脱毒组织培养技术研究，解决了微茎尖切割、接种、分化及生根移栽等一系列技术难题，获得了Ｓ２０、Ｓ１８一批脱毒试管苗及移栽壮苗。分化数分别达２．０和３．６，生根率达７６．１％和９０．０％，平均根长２ｃｍ以上，平均根数５要，移栽成活率达７８％。     

抗寒苹果“新冠”的茎尖组织培养

以苹果"新冠"茎尖为材料,通过研究不同的激素配比对芽增殖和生根的影响,探索抗寒苹果"新冠"的最适增殖培养基和生根培养基.结果表明:"新冠"的最适诱导培养基为MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA;最适增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05或0.08 mg/LNAA,其增殖系数达到7.4;最适生根培养基为1/2MS+0.2 mg/L IBA+0.6 mg/L IAA,其生根率达到90.5%.     

利用Y2H筛选西方烟中与苹果茎痘病毒CP互作的蛋白

苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus,ASPV）是苹果和梨树上普遍发生的潜隐病毒之一，西方烟（Nicotianaoccidentalis）是其重要的草本寄主之一。在本研究中，构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP(CP-BD)，并从西方烟cDNA文库中筛选与ASPV CP互作的蛋白。经通过酵母双杂交回转验证和NCBI BLAST比对，获得30种可能与ASPV CP互作的西方烟蛋白质，为研究ASPV侵染致病的分子机制及CP在侵染过程中的功能打下基础。     

利用3''''和5''''RACE克隆新疆梨树苹果茎痘病毒末端序列

采用RACE技术对库尔勒香梨苹果茎痘病毒进行研究,获得了梨树苹果茎痘病毒5'和3'末端序列.研究结果表明,本试验采用的3'和5'末端快速扩增技术(3'RACE和5'RACE技术)能很好地扩增苹果茎痘病毒的末端序列,分别获得了长度为329 bp和367 bp的片段,通过与NCBI核酸数据库中已经发表的序列NC_003462进行比对分析,发现梨树ASPV 3'末端含有131个核苷酸非编码序列,具有poly(A)尾,5'末端含有34个核苷酸非编码序列,其同源性与已发表的序列分别为78%和84%,为获得梨树ASPV病毒全长基因组和基因组功能结构分析奠定了基础.     

草本威灵仙的组织培养与快速繁殖

 用种子切段作外植体，建立了草本威灵仙的组织培养和再生体系。试验结果表明：草本威灵仙种子切段诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA 3 mg·L^-1 +NAA 0.3 mg·L^-1，诱导率达86.7％；附加6-BA 2 mg·L^-1+NAA 0．2 mg·L ^-1的Ms培养基有利于芽的分化和增殖，培养60 d左右，每个外植体分化形成的再生小植株数达到12～18个；在1/2 MS+IBA 0.5 mg·L^-1 的培养基中生根效果最好。移植时喷施营养液可以提高幼苗的成活率。     

苹果组织培养研究概况

阐述组织培养在苹果上的应用情况,以期为后续的苹果生物技术育种,尤其是转基因育种提供参考。     

甘肃徽县银杏茎尖茎段组织培养试验研究

通过对徽县地方银杏良种田河银杏进行茎尖茎段的组织培养试验研究得知：在当地外植体的最佳采摘时间为5月下旬～4月下旬，初代培养的最佳部位为中部、上部，初代培养时加入活性炭能有效防止外植体褐化。继代扩繁的最佳培养基为MS＋6-BA1．0～2．Omg／L＋NAAO．5mg／L＋2，4-D0．1mg／L或MS＋KT1．0mg／L＋NAA0．5mg／L＋2，4-D0．1mg／L；壮苗培养基为MS＋6－BA1．0mg／L＋NAA0．5mg／L；1／2MS＋IBA0．8～1．0mg／L及MX＋IBA0．8～1．0mg／L是银杏适宜的生根培养基，通过适当地炼苗移栽和栽培管理，能有效提高成活率。     

东北龙胆茎段组织培养的研究

以东北龙胆茎段为外植体,以MS为基本培养基,添加不同浓度的BA及NAA,筛选诱导不定芽及生根的最佳培养基。结果表明:以70%酒精处理60 s+0.1%升汞处理10 min,成活率可达97.5%;以MS+BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L为不定芽诱导培养基,诱导率可达94.44%,试管苗在1/2MS+IBA 0.5 mg/L生根培养基平均生根率为94.74%。     

包埋干燥超低温保存苹果离体茎类

选用继代培养７０ｄ的苹果离体茎尖,在５℃条件下低温驯化３周,经不同浓度蔗糖顶培养及藻酸钠包埋后,在无菌空气中干燥脱水４ｈ直接投入液氮,化冻后茎尖存活率达７０％以上。通过选择材料的生理状态可缩短和简化保存过程。     

利用3′和5′RACE克隆新疆梨树苹果茎痘病毒末端序列

采用RACE技术对库尔勒香梨苹果茎痘病毒进行研究,获得了梨树苹果茎痘病毒5′和3′末端序列。研究结果表明,本试验采用的3′和5′末端快速扩增技术（3′RACE和5′RACE技术）能很好地扩增苹果茎痘病毒的末端序列,分别获得了长度为329 bp和367 bp的片段,通过与 NCBI 核酸数据库中已经发表的序列NC_003462进行比对分析,发现梨树ASPV 3′末端含有131个核苷酸非编码序列,具有 poly(A)尾,5′末端含有34个核苷酸非编码序列,其同源性与已发表的序列分别为78%和84%,为获得梨树ASPV病毒全长基因组和基因组功能结构分析奠定了基础。     

枣茎段组织培养的研究

以5个枣品种的茎段为外植体,进行了不定芽的诱导和成苗的研究。在培养基MS+ZT1.75mg/L+KT2.0mg/L+NAA穴0～1.0mg/L雪上,枣茎段可以直接分化不定芽,MS+ZT1.75mg/L+KT2.0mg/L+NAA0.015mg/L培养基最适宜茎段不定芽的诱导。5个枣品种在不定芽的诱导方面存在较大差异培养60d时鸡蛋枣的增殖倍数达到3.0,而尖枣仅0.32。保持叶片2～3枚有利于枝条生根,在1/2MS+IBA0.8mg/L培养基上生根率达90%以上。     

“男恋姬”苹果的茎尖培养与快繁

以日本早熟苹果 新品种“男恋姬”为试 材,研究苹果茎尖离体培养与快繁,结果表明,起始培养以 Ｍ Ｓ＋ Ｂ Ａ１ ＋ Ｉ Ａ Ａ０２ ＋ Ｇ Ａ０１ ＋ Ｖ Ｃ８ 为 最佳。继代 增殖阶段以 Ｍ Ｓ［（ Ｎ Ｈ４） ２ Ｓ Ｏ４６４９］ ＋ Ｂ Ａ１ ＋ Ｉ Ｂ Ａ０２ 为最佳。生根培养以１／２ Ｍ Ｓ＋ Ｉ Ｂ Ａ０２ ＋ Ｎ Ａ Ａ０１ 效果最好。试管苗移栽前经强光闭瓶炼 苗２０ｄ ,移 栽后气 温控制 在２０ ℃～２８ ℃,空气相 对湿 度在 ９０ ％ 以上, 光强 在 ２００００ Ｌ Ｘ时,并经 常 喷 药 剂 保 护 防 止 根 颈 发 病, 成 活 率 可 达８０ ％ 。     

华木莲茎段组织培养初探

华木莲是我国特有珍稀濒危树种,花果美丽,具有较高观赏价值。以华木莲一年生半木质化枝条为材料,研究消毒时间、基本培养基和激素对华木莲茎段组织培养的影响。结果表明:华木莲半木质化茎段组织培养用浓度为0.1%HgCl_2消毒7min,存活率和萌芽率最高,分别为31.25%、20.63%;华木莲茎段组织培养适宜基本培养基为MS培养基,褐化率低,存活率、愈伤率、萌芽率高;华木莲腋芽萌芽的适宜激素浓度为MS+1.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L IBA,腋芽萌芽率在26.50%～29.83%之间,但华木莲芽的继代培养难以增殖,有待进一步深入研究。     

魔芋茎尖组织培养及快速繁殖技术研究

以魔芋茎尖为外植体,进行愈伤组织诱导、芽分化及植株再生的研究。研究结果表明,最佳茎尖剥取材料是无菌试管苗。刚剥离的茎尖需要预培养30d,然后将膨大的茎尖四周给予伤口后再转接到MS 6-BA 0.6 mg/L NAA 0.1 mg/L上进行愈伤组织诱导;芽分化最适培养基是MS 6-BA 2.0 mg/L NAA 0.5 mg/L;切割后的芽在生根培养基1/2 MS NAA 0.1 mg/L上能100%形成完整植株。     

魔芋茎尖组织培养及快速繁殖技术研究

以魔芋茎尖为外植体,进行愈伤组织诱导、芽分化及植株再生的研究.研究结果表明,最佳茎尖剥取材料是无菌试管苗.刚剥离的茎尖需要预培养30 d,然后将膨大的茎尖四周给予伤口后再转接到MS 6-BA 0.6 mg/L NAA0.1 mg/L上进行愈伤组织诱导;芽分化最适培养基是MS 6-BA 2.0 mg/L NAA 0.5 mg/L;切割后的芽在生根培养基1/2 MS NAA 0.1 mg/L上能100%形成完整植株.