多重RT-PCR同时检测6种马铃薯病毒及1种类病毒

病毒病是限制我国马铃薯生产的重要因子之一。本研究通过引物设计和体系优化建立了一套多重RT-PCR检测方法,可以在一个反应体系中同时检测6种马铃薯病毒和1种马铃薯类病毒以及1个马铃薯内参基因,包括马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY)、马铃薯M病毒(potato virus M, PVM)、马铃薯S病毒(potato virus S, PVS)、马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)、马铃薯A病毒(potato virus A, PVA)、马铃薯卷叶病毒(potato leaf curl virus, PLRV)、马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid, PSTVd)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunitⅠ,CoxⅠ)基因的特异片段,产物大小依次为181、226、275、565、630、681、359、500 bp,符合理论预期。采用建立的方法以相应病毒和类病毒的质粒作模板进行检测,其检测灵敏度在1.6×10^-3～1.8×10^-1 ...     

马铃薯种苗复合感染病毒多重RT-PCR同步快速检测

 基于马铃薯病毒ssRNA的快速制备方法,根据马铃薯病毒CP基因序列设计PVX、PVS、PVY和PLRV特异性引物对、P1基因序列设计PVA特异性引物对,建立了多重RT PCR快速检测体系,可以同步检出复合侵染马铃薯种苗主要病毒,灵敏度比传统的ELISA至少高100倍。结合生物活性稳定剂研制的固相化检测试剂盒,已用于四川和重庆等15个县市田间与苗圃248个马铃薯显症或无症样品的实际检测,表明四川和重庆地区2~3种马铃薯病毒往往复合侵染(PVX、PVA和PVS三种病毒复合侵染或PLRV和PVY二种病毒复合侵染)。     

4种葡萄卷叶伴随病毒多重RT-PCR检测

 葡萄受卷叶伴随病毒侵染后,树势减弱,抗逆性变差,果穗着色不良,成熟期推迟,含糖量降低。目前已报道11种葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV)。为提高检测效率,降低检测费用,本文在研究单个卷叶伴随病毒RT-PCR检测技术基础上,对4种葡萄卷叶伴随病毒的多重RT-PCR模板浓度、引物浓度和退火温度进行优化,建立了同时检测葡萄卷叶伴随病毒-1(GLRaV-1)、葡萄卷叶伴随病毒-3(GLRaV-3)、葡萄卷叶伴随病毒-4(GLRaV-4)和葡萄卷叶伴随病毒-5(GLRaV-5)的多重RT-PCR技术体系。模板浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、退火温度和循环次数对多重RT-PCR检测结果均有较大影响,而在一定范围内改变延伸时间和dNTP浓度对检测结果影响较小。对4种葡萄卷叶伴随病毒的PCR产物进行克隆和测序,扩增基因片段与GenBank中登录的基因序列同源性为95%~99%。所建立的多重RT-PCR技术检测田间样品效果良好。     

马铃薯卷叶病毒分子鉴定及一步RT-PCR检测

病毒病的危害对马铃薯产量和品质构成较严重的影响.2003年初广东省阳东县田间约70%的植株呈现典型的马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)病症状.为此,笔者对其病原进行了分子鉴定,并建立了一步RT-PCR检测技术.     

侵染西瓜的5种病毒ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV的多重RT-PCR检测体系的建立与检测应用

 根据5种病毒小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的核苷酸保守区序列,设计特异性引物对,从影响多重RT-PCR (mRT-PCR)扩增的引物浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行反应体系的优化,建立了一种能够同时检测ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV的多重RT-PCR技术体系,并进行了实际应用。在一个体系中对上述5种病毒复合侵染的西瓜材料进行多重RT-PCR扩增,得到与试验设计相符的5条特异性条带,依次是542、485、410、354和293bp。该体系实现了对侵染西瓜的5种病毒的同时检测,极大地提高了检测效率,降低了检测成本,体现了多重RT-PCR的优越性。     

4种大豆种传病毒多重RT-PCR检测

进境大豆携带的病毒主要有菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、烟草条纹病毒(TSV)和南方菜豆花叶病毒(SBMV)等,均为大豆种传病毒,可随大豆种子实现远距离传播。本研究对这4种大豆病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物,并通过优化引物、模板浓度和扩增参数,在一个体系中成功对4种病毒进行了多重RT-PCR扩增,得到307bp、206bp7、17bp5、18bp共4条特异性条带,建立了能同时检测BPMV、TRSV、TSV和SBMV的多重RT-PCR检测体系。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性强,在出入境检疫中具有广泛的应用前景。     

葡萄卷叶伴随病毒4和5简并引物和多重PCR检测

研究建立了葡萄卷叶伴随病毒4和5(Grapevine leafroll associated virus 4and 5,GLRaV-4and 5)的简并引物及多重PCR检测方法。比较了单一PCR、多重PCR和简并引物检测方法的灵敏度,并对简并引物的特异性进行了分析。结果表明,采用简并引物和多重PCR对这两种病毒进行检测,其灵敏度与单一PCR相同,且简并引物仅对葡萄卷叶伴随病毒4和5具有特异性。本研究建立的方法能够同时、快速、灵敏地检测上述2种葡萄卷叶病毒,提高了检测效率,降低了检测费用。     

以18S rRNA为内参照的多重RT-PCR检测3种百合病毒

 本研究对多重PCR体系各成分和循环参数进行了摸索和优化,建立了以18SrRNA为内参照的同时检测3种百合病毒的多重RT-PCR体系,所检测的3种病毒是黄瓜花叶病毒(CMV)、百合斑驳病毒(LMoV)和百合无症病毒(LSV)。它们为侵染我国百合的主要病毒。在RT反应体系中加入3种病毒和18S rRNA的特异性反向引物的混合物,使反应体系中各反向引物终浓度均为0.5μmol/L,反转录酶(AMV)反转录合成各病毒和18SrRNA的互补第一链cDNAs。多重RT-PCR条件实验显示:将标准RT-PCR体系中的Taq HS DNA聚合酶量改为0.100U/μL,Mg²⁺浓度改为4.0mmol/L,各引物浓度选择0.2μmol/L,那么25个循环反应以上就能在一个反应管中以18SrRNA为内参照同时检测百合中的3种常见病毒。用该体系检测了10个百合样品,同时与³²P同位素标记膜杂交检测作对照,结果显示,该检测体系检测灵敏度更高。     

五种烟草病毒TMV、CMV、TEV、PVY及TVBMV的多重RT-PCR同步检测

 我国烟草病毒主要有烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV),通常发生复合侵染。本研究对我国5种烟草病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物,通过优化引物和模板浓度,摸索扩增参数,在一个体系中成功对5种病毒复合侵染的烟草材料进行多重RT-PCR扩增,得到237、273、347、456和547 bp共5条特异性条带,建立了能同时检测TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV的多重RT-PCR检测体系。对田间样品检测结果证明,多重RT-PCR体系能够同时检测5种病毒,并且灵敏度高。     

马铃薯X病毒荧光定量PCR检测体系的建立及应用

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是危害茄科作物的一种重要病毒,为了建立特异性检测PVX的实时荧光定量PCR体系,本研究以PVX-1985分离物中外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列为模板,设计引物构建重组质粒并选择扩增效率高、特异性强的引物成功构建出标准曲线。利用建立的体系,成功检测到以含pCaPVX440侵染性克隆载体的农杆菌C58C1接种后的本氏烟(Nicotiana benthamiana)中PVX病毒RNA的拷贝数。     

4种番茄病毒多重RT-PCR检测及应用

<正>番茄是全世界栽培最为普遍的果菜之一,2011年世界番茄栽培面积约805万亩,年产量约3 773万t,我国是世界番茄种植大国之一,2011年面积96667公顷,产量约679万t,随着番茄种植面积不断扩大,番茄病毒病的危害逐年加重~([1])。世界范围内番茄除了已有的TMV抗病资源与育成的抗     

3种甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用

正病毒病是引起甘薯品质降低和减产的重要原因之一,现已报道30多种能侵染甘薯的病毒~([1,2])。山东省是甘薯种植大省,病毒种类近10种~([3,4])。甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFM V)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)是为害甘薯的主要病毒,在全国甘薯种植区广泛分布~([5,6])。甘薯病毒2(Sweet potato virus 2,SPV2)为Potyvirus的一个暂定种,多与同属的其他病毒混合侵染~([7])。多重PCR技术由Chamberian等~([8])1988年首次提出,可实现多基因的同时扩增,具有节省时间、提高效率的优点,已初     

利用多重PCR技术快速检测4种水稻病原细菌

对水稻中多种病原细菌的检测,使用常规方法往往耗时耗力,而多重PCR可以更加高效地进行多种细菌的检测.根据水稻细菌性谷枯病菌gyrB基因,水稻细菌性叶鞘褐腐病菌PfsI/R quorum sensing位点以及水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌含铁细胞接受因子基因设计引物,建立4种水稻病菌的多重PCR检测方法,对方法进行...     

利用多重RT-PCR技术检测草莓病毒的研究

 目前已报道侵染草莓的病毒有20多种,其中草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus, SMoV)、草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus, SMYEV)和草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)是分布较广、危害较重的3种主要病毒。     

中国甘薯病毒种类的血清学和分子检测

 2009～2010年,从我国18个省（市）采集了176份表现病毒病症状的甘薯样品。利用血清学、PCR和核苷酸序列测定的方法,对上述样品中的病毒种类进行了鉴定。血清学检测结果表明,供试样品中甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）的阳性率最高,达56.3%,其次为甘薯G病毒（SPVG）和甘薯类花椰菜花叶病毒(SPCaLV),阳性率分别为34.1%和33.5%。PCR和核苷酸序列测定结果表明,我国甘薯上至少存在SPFMV、SPVG、甘薯潜隐病毒（SPLV）、甘薯褪绿斑病毒（SPCFV）、甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、甘薯脉花叶病毒（SPVMV）和甘薯卷叶病毒（SPLCV）8种病毒。此外,供试样品中没有检测出甘薯轻斑驳病毒（SPMMV）,是否存在甘薯轻斑点病毒(SPMSV)、SPCaLV和C 6病毒尚不能确定。     

蚜虫共生细菌多重PCR检测体系的建立

蚜虫中具有多种共生菌,使用常规PCR对它们进行检测,耗时耗力,而多重PCR可以更加高效地进行多种细菌的检测。沃尔巴克氏菌Wolbachia pipientis、杀雄菌属共生菌Arsenophonus和蚜虫U型共生菌Regiella insecticola是蚜虫中常见的3种共生菌。本研究针对沃尔巴克氏菌、杀雄菌属共生菌和蚜虫U型共生菌,分别选择以wsp基因、yaeT基因和gltA基因作为靶标,进行了多重PCR引物的设计和扩增体系的优化。结果显示,本研究建立的多重PCR体系在检测3种蚜虫常见共生菌时,具有较高的扩增特异性、准确性和直观性及较高的检测灵敏度,共生菌的最低检测浓度为104拷贝/μL,远低于共生菌在蚜虫1龄若虫总DNA中的浓度(108拷贝/μL),可以完全满足蚜虫共生菌检测工作的需要。