H3N8亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立简便、快速检测H3N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的方法,本研究根据H3和N8亚型AIV的HA和NA基因保守序列,设计合成了2对特异性引物和2条Taq Man探针,通过优化反应条件建立了H3N8亚型AIV一步法实时荧光定量RT-PCR。结果表明:该方法敏感型好,对H3N8亚型AIV检测敏感性达100个模板拷贝数。该方法特异性强,仅对H3和N8亚型AIV检测为阳性;应用该方法对96份临床样品进行检测,结果与病毒分离鉴定结果一致。因此,本研究建立的H3N8亚型AIV一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法具有简便、快速、敏感和特异等优点,可为H3N8亚型AIV感染的有效防控提供技术支撑。     

H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

H7亚型禽流感病毒致病性强、危害性大,是进出口家禽及禽类产品的主要检疫对象。为了加强对H7亚型禽流感病毒的检测,建立新的快速检测方法。通过对GenBank已报道的H7亚型禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了两套分别针对H7N2亚型和H7Nx亚型的特异性引物和用FAM标记的Taq Man MGB核酸探针,建立了H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR方法(Real-time RT-PCR)。该方法特异性好,不存在假阴性和假阳性的现象;敏感性高,对禽流感病毒H7亚型标准HI抗原检测的敏感性达到10-5,能够满足口岸禽流感病毒快速、准确、有效的检疫需求。     

H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据H9亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以阳性H9亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明:本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度约为6拷贝/μL,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好,重复性佳,对193份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%。该方法为H9亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、较便宜、高通量、生物安全性好的定量检测手段,将在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速、特异、敏感的H6亚型禽流感病毒(AIV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。针对H6亚型AIV的血凝素(HA)基因序列保守区设计1对引物,并优化反应条件。结果表明,该方法的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA,与常规PCR相比,灵敏度高出1 000倍;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(80.81±0.08)℃,组内变异系数为0.08%～0.99%,组间变异系数为1.85%,可重复性好;对H1、H3、H5、H7、H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒等其他呼吸道病原体无扩增;检测快速,从样本处理到报告结果仅需3.5 h。     

H3和H4亚型禽流感病毒双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据H3和H4亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和用不同荧光基团标记的Taq Man探针。通过优化反应条件建立了H3和H4亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示该法特异性好,敏感性达1 000拷贝/μL;组内重复与组间重复性的平均变异系数均小于3%;应用该法对96份临床样品检测,结果与病毒分离鉴定结果一致。建立的H3和H4亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,可用于H3和H4亚型AIV的快速诊断和监测。     

禽流感病毒H9和N2亚型双重RT-PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测H9及N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,根据AIV H9亚型和N2亚型基因序列,分别设计了2对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因的引物,建立了H9亚型和N2亚型AIV双重RT-PCR检测方法。对H9N2亚型AIV的RNA模板进行RT-PCR扩增,可得到545bp H9基因特异性条带和341bp N2基因的特异性条带;对非H9亚型的N2亚型AIV进行扩增,则仅出现1个特异性扩增条带,即341bp N2基因条带;对非H9或N2亚型AIV和其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。结果表明该双重RT-PCR最低能检出100fg H9N2亚型AIV的cDNA模板。     

H9N2亚型禽流感荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为了研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在家禽体内各个器官的分布,试验针对H9N2亚型AIV的HA基因设计1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin的引物,以阳性重组质粒作为标准品做标准曲线,建立荧光定量RT-PCR检测方法,并对人工感染H9N2的SPF雏鸡气管、胸腺、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠等器官进行3次重复检测。结果表明:该法线性关系R值均在0.99以上,检测极限均为10拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性好,批内和批间重复性试验变异系数均小于1%。通过比较各器官HA相对表达量,得出肠和胰腺中HA相对表达量最高,腺胃次之,脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊中含量也比较高,气管、肺脏、肾脏中含量较低,其中肾脏含量最低。说明研究建立的H9N2亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR方法灵敏度高,特异性强。     

禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为满足禽流感病毒高通量快速检测的需要,建立了一种能够检测各亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评估,使用该方法与农业行业标准NY/T772—2013中的禽流感病毒RT-PCR方法同时进行临床样品检测。结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10-4 ng/μL,与传统的RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本方法能实现对禽流感病毒的安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量检测,从而弥补了现有传统检测技术的不足。     

H10亚型和N8亚型禽流感病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank中H10亚型和N8亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因保守序列,分别设计筛选出2对特异性引物,用于H10亚型和N8亚型AIV的检测,优化引物之间的浓度,建立了同时检测H10亚型和N8亚型AIV的双重RT-PCR检测方法。该方法对H10N8亚型AIV可特异性扩增出267 bp(H10亚型)和464 bp(N8亚型)目的条带,对H10Ny(y≠8)亚型AIV仅扩增出267 bp目的条带,对HXN8(x≠10)亚型AIV仅扩增出464 bp目的条带,对其他亚型AIV和常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该方法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限均为104拷贝数/μL。本研究建立的H10亚型和N8亚型AIV双重RT-PCR特异性强、灵敏度高,可同时快速检测H10亚型和N8亚型AIV,为其感染的快速鉴别诊断提供一种简便、快速和有效的方法。     

禽流感病毒 H3N2亚型三重 RT-PCR 检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒（AIV ）且同时区分 H3N2亚型AIV 的方法,本研究根据 H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M 基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT‐PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518 bp为AIV M 基因、418 bp为N2亚型AIV NA基因、271 bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518 bp、271 bp和518 bp、418 bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518 bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对 H3N2亚型AIV的检测下限为100 pg ;96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。     

Establishment of a Duplex Real-time RT-PCR for Detection of H6N1 Subtype Avian Influenza Virus

According to the sequences of HA and NA genes of H6 and N1 subtype avian influenza virus (AIV),two pairs of specific primers and two TaqMan probes with different fluorescence were designed.The duplex Real-time RT-PCR assay was developed and optimized to simultaneously detect H6 and N1 subtypes AIV in one reaction.The result showed that the specificity of this assay was high and only amplified H6 and N1 subtypes AIV,and was not cross-reactive with other H and N subtypes AIV,newcastle disease virus and infectious bronchitis virus.The detection limit of this assay was 100 copies/μL of H6N1 subtype AIV.This newly developed duplex Real-time RT-PCR assay was a rapid,specific and sensitive method for the detection of H6N1 subtype AIV,and it could provid a technical support to prevent and control H6N1 subtype AIV.     

H6N1亚型禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针.经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法.该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增,对其他H亚型AIV、N亚型AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体的检测均为阴性;该法敏感性好,对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μL.本试验建立的H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异的优点,为H6N1亚型AIV的防控提供技术支撑.     

禽流感病毒与鸡细小病毒二重PCR检测方法的建立

为建立一种能同时鉴别诊断禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）和鸡细小病毒（chicken parvovirus,ChPV）的检测方法,本研究根据GenBank中AIV的M基因和ChPV的NS基因保守序列,分别设计并筛选出两对特异性引物,用于AIV和ChPV的检测。通过优化反应条件,建立了AIV和ChPV二重PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异好,能同时检测AIV和ChPV,对其他常见的禽病病原体均未反应;该法对AIV和ChPV的检测下限均为100 fg;对159份临床样品检测结果与PCR阳性产物测序结果一致。本研究建立的AIV和ChPV二重PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高的特点,对AIV和ChPV的防制具有重要意义。     

Development of a Duplex PCR Assay for Detection of Avian Influenza Virus and Chicken Parvovirus

In order to establish a method to simultaneously detect avian influenza virus (AIV) and chicken parvovirus (ChPV),two pairs of specific primers were designed according to the sequences of AIV M gene and ChPV NS gene in GenBank. The duplex PCR assay was established by optimizing the reaction conditions.The tests showed that this method had high specificity, could simultaneously detect AIV and ChPV and no specific band was amplified for other subtypes avian pathogenic virus. The sensitivity result showed that the lower detection limit of this method was 100 fg. The results of 159 clinical samples were consistent with the sequencing results of PCR positive product. The double PCR methods for detection of AIV and ChPV established in this study had the characteristics of good specificity and high sensitivity, which was of great significance to the prevention control of AIV and ChPV.     

H1亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种检测H1亚型禽流感病毒(AIV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法.根据对GenBank中H1亚型AIV HA基因序列的分析,设计针对H1亚型AIV的HA基因特异性引物,并以H1亚型AIV的cDNA为模版,构建重组阳性质粒.采用梯度稀释重组标准品阳性质粒DNA的方法,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(real-time PCR)标准曲线.敏感性试验结果显示,扩增效率和标准误差分别为100.9％和0.011 7,熔解曲线呈单一熔解峰.在35个Ct值内该方法可检测到100个拷贝的标准品DNA;特异性试验结果显示,该方法对于其他亚型AIV和禽呼吸道病原体不能检出;重复性试验结果显示,组内变异系数小于1％.建立的Real-time PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于临床上H1亚型AIV的检测.     

H4亚型和N2亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种简单、快速鉴别H4亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,针对H4亚型AIV HA基因和N2亚型AIV NA基因的保守区域,分别设计筛选出1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H4亚型和N2亚型AIV二重RT-PCR检测方法。该法可特异性扩增H4亚型和N2亚型AIV,对其他亚型AIV和常见禽病病原体无交叉反应;对H4亚型和N2亚型AIV的检测下限均为10~4拷贝/μL;对152份临床样品的检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究建立的二重RT-PCR方法为H4亚型和N2亚型AIV的诊断提供了快速、特异、敏感和有效的检测方法。     

H7N9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

In order to develop a rapid and simultaneous assay for H7N9 subtype avian influenza virus （AIV）, three pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of the hemagglutinin (HA) gene of H7 subtype AIV, the neuramidinase (NA) gene of N9 subtype AIV, and the matix (M) gene of all subtypes AIV. The reaction conditions were optimized, and the specificity and sensitivity of this method were evaluated to develop a triplex PCR assay. It was shown that H7N9 subtype AIV could be amplified into three specific bands by this triplex PCR, the lengths of these bands were 330 (H7 AIV), 207 (N9 AIV) and 632 bp (all AIV), respectively. Samples containing H7 or N9 subtype AIV could be amplified into two specific bands, which were 330 and 632, 207 and 632 bp, respectively. Samples containing other subtypes AIV could be amplified into a 632 bp specific band. No specific band was amplified from other avian pathogenic virus. Sensitivity test results showed that as low as 10³ copies/μL H7N9 subtype AIV could be detected. This triplex PCR could simultaneously diagnose H7N9 subtype AIV, single H7 subtype AIV, single N9 subtype AIV and other subtype AIV in one tube. This assay was a rapid, specific and sensitive method for the detection of H7N9 subtype AIV. It could be applied in rapid diagnosis for clinical samples, and also provided a technical support to prevent and control H7N9 subtype AIV.     

H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种能同时快速检测H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中H9亚型 AIV的HA基因和DTMUV的NS2基因序列,分别设计了1对针对H9亚型AIV和DTMUV保守基因序列的引物。利用这2对引物对混有H9亚型AIV和DTMUV的cDNA模板进行二重PCR扩增,得到了2个大小与试验设计相符的特异性扩增条带。利用本试验建立的二重PCR对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。利用这2对引物对H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为6.3和 6.6 pg。对临床235份样品检测的结果表明该二重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。     

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。