毕赤酵母基因工程菌高密度发酵及其应用研究

构建重组毕赤酵母基因工程菌表达外源目的产物是获取新生物制品的有效途径,高密度发酵是实现这些产品规模化、低成本生产的关键技术。文章对影响毕赤酵母基因工程菌高密度发酵的因素和调控措施(如基因工程菌、培养基、生长阶段菌体密度及比生长速率),以及发酵过程中参数调控和毕赤酵母基因工程菌高密度发酵的应用等进行了综述,并提出该体系存在的问题。     

新生猪腹泻大肠杆菌K88K99双价基因工程疫苗

中国农科院哈尔滨兽医研究所的科研人员利用现代基因工程技术手段,人工构建出非产肠毒素性且具有K88 K99两种保护性抗原的大肠杆菌菌株,通过接种于适宜培养基发酵高密度培养,成功试制出了新生猪腹泻大肠杆菌K88 K99双价基因工程疫     

新生猪腹泻大肠杆菌K88K99双价基因工程疫苗

中国农科院哈尔滨兽医研究所的科研人员利用现代基因工程技术手段,人工构建出非产肠毒素性且具有K88 K99两种保护性抗原的大肠杆菌菌株,通过接种于适宜培养基发酵高密度培养,成功试制出了新生猪腹泻大肠杆菌K88 K99双价基因工程疫苗。该疫苗于1990年荣获中国农科院科技进步一等     

K88和K99双价基因工程菌C株与E株表达效果的比较

应用ＬＢ培养基３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１７小时,室温４０００ｒ／ｍｉｎ,离心３０分钟,收集沉淀菌体,用ＰＢＳ离心洗涤一次,沉淀物重悬于适量的ＰＢＳ中。三等分菌体悬浮液分别用超声波、冻融、热休克等方法处理后,室温８０００ｒ／ｍｉｎ离心３０分钟,取上清液加入饱和硫酸铵４℃过夜,沉淀蛋白经透析,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０过柱纯化。应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、凝胶扫描测定Ｋ８８、Ｋ９９蛋白的分子量及浓度,双向免疫扩散、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ试验测定其抗原性。结果表明,热休克法分离纤毛抗原是最好的方法,从Ｃ株Ｅ株分离得到的纤毛抗原,在分子量大小及对单抗亲和反应能力方面没有明显的差异。     

K88和K99双价基因工程菌C株与E株表达效果的比较

应用ＬＢ培养基３７℃,１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１７小时,室温４００ｒ／ｍｉｎ,离心３０分钟,收集沉淀菌体,用ＰＢＳ离心洗涤一次,沉淀物重悬于适量的ＰＢＳ中,三等分离体悬浮液分别用超声波,冻融,热休克等方面处理后,室温８０００ｒ／ｍｉｎ离心３０分钟,取上清液加入饱和硫酸铵４℃过夜,沉淀蛋白经透析,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０过柱纯化,应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,凝胶扫描测定Ｋ８８、Ｋ９９蛋白的分子量及浓度,     

鸭沙门菌高密度发酵工艺的研究

为了提高鸭沙门菌的生产量,简化生产流程降,低生产成本。以GMP为生产指导原则,采用10L发酵罐对影响鸭印第安纳沙门菌高密度发酵的温度、pH值、相对溶氧量、接种量等7个方面进行单因子优化试验。研究结果显示,鸭印第安纳沙门菌在以4%接种量,培养温度为38℃,维持培养基的pH值为7.5,保持溶氧量为40%,150rpm/min的转速和连续补加葡萄糖的方式培养20h后,发酵菌数可达到53.7亿CFU/ml,本研究结果为沙门菌疫苗大规模发酵生产奠定了基础。     

猪K88、K99、987P、F41埃希氏大肠杆菌高密度发酵培养技术的初步探讨

采用高密度发酵和普通深层通气两种方法培养含K88、K99、987P、F41菌毛抗原的四株猪埃希氏大肠杆菌,对其培养液进行活菌数、OD值、pH值、效价的测定。实验结果表明,运用高密度发酵方法培养,各菌活菌数可达4.1×1010~4.9×1010CFU/mL,效价为211~213;运用普通深层通气方法培养,各菌活菌数为0.51×1010~0.59×1010CFU/mL,效价为24~25,可选择高密度发酵方法替代普通深层通气方法培养,用于制备猪埃希氏大肠杆菌K88、K99、987P、F41四价菌毛提纯苗。     

蛋白核小球藻高密度高蛋白发酵工艺研究

试验旨在提高蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的生物量和蛋白含量,对发酵配方和发酵工艺进行优化.采用Design-Expert 12 Perfect软件对复合碳源、氮源和维生素等13种因子进行Plackett-Burman筛选,得到显著效应因子为复合碳源(葡萄糖+淀粉,按2.5∶1.0的比例添加能够增加核蛋白小球藻发酵产量)、有机氮源(尿素)、维生素B12(VB12).对上述3个显著效应因子进行Box-Behnken试验设计,通过响应面分析获得最优添加量为复合碳源7.4 g/L、尿素8.8 g/L、VB120.4 g/L.经250 mL和1000 mL三角摇瓶培养基试验验证以及50 L发酵罐补料工艺验证,得出3个不同水平发酵的效果均高于对照组,藻体密度分别提高38.9%、31.1%、42.5%,蛋白浓度分别提高29.8%、31.0%、31.4%.研究表明,优化补料条件下,蛋白核小球藻50 L发酵罐OD680 nm值为0.929,干重91.64 g/L,蛋白含量达43%.     

植酸酶基因工程菌的发酵研究

对植酸酶基因工程菌（E-22）发酵产植酸酶条件作的。研究结果表明。接种龄36h,接种量10％,增菌时间72h,发酵液pH6．0,甲醇添加量15％,装液量10％,诱导表达120h能很好的提高产酶,测得酶活164416.7 IU／mL。发酵培养基中添加抗生素或表面活性剂对发酵产酶有一定的抑制作用。     

牛分支杆菌DNA疫苗工程菌的高密度培养研究

对牛分支杆菌三价DNA疫苗工程菌进行了高密度培养的探索。通过摇瓶培养试验对3种培养基进行了筛选,选择出具有高密度培养潜力的半合成培养基作为中试规模的发酵罐培养基;经对培养温度、溶氧、pH、转速、补料方式等各种条件优化,培养的工程菌密度OD600达到22.92,细菌湿重达到27.173 g/L,质粒产量为1.44 mg/g湿菌。试验还对培养物质粒的稳定性进行了证实。     

K88-K99-987P-F41菌毛疫苗预防仔猪黄痢的效果

仔猪大肠杆菌性腹泻是养猪场最常见的疾病之一。而肠毒源性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病菌之一。其致病的前提是必须能在小肠黏膜定居、繁殖并产生肠毒素。ETEC表面能产生菌毛粘附因子使得这些菌株很容易吸附并定居于小肠黏     

利用基因工程改造瘤胃微生物调控瘤胃发酵研究进展

DNA分子的人工合成是基因工程技术的基础,改变反刍动物瘤胃微生物DNA的结构,能够使得动物表达出不同的蛋白质,反刍动物的生长模式也因此而发生不可预知的改变。正在应用的或处于研究阶段的构建瘤胃基因工程菌的方式主要有基因缺失技术、基因复制性重组技术和启动子的应用技术。其中基因缺失技术还包括转座子插入法和自杀性质粒的构建。目前影响基因工程技术成功率的最主要障碍就在于这种技术的低效率和不可预知性,一旦清除了这个障碍,基因工程技术将会在瘤胃微生物的改造上有更加广阔的发展空间。     

大肠埃希菌K88ac菌毛蛋白亚基因的原核表达及其免疫原性研究

从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体形式获得高效表达.Western blot结果显示,表达的蛋白能够被K88ac单抗识别,用纯化的蛋白免疫小鼠,能够抵抗1 MLD大肠埃希菌强毒株C83902的攻击,这表明构建的工程菌株XL1-Blue(pQE30-K88ac)可以作为预防幼畜大肠埃希菌性腹泻基因工程菌苗的候选株.     

副猪嗜血杆菌高密度发酵条件的优化及初步应用

通过单因素试验考察了碳源、氮源、血清及辅酶对副猪嗜血杆菌培养的影响,并在单因素试验的基础上,选取蔗糖、酵母粉、硫酸铵及马血清进行4因素3水平试验,最终确定蔗糖2 g/L、酵母粉2 g/L、硫酸铵2 g/L、马血清5%为最优培养基配方。在10 L发酵罐上进行副猪嗜血杆菌分批补料发酵,对比不同补料方式对副猪嗜血杆菌发酵的影响,结果表明利用恒葡萄糖浓度补料将残糖浓度维持在1 g/L时可取得较好的发酵效果,菌体密度及活菌数目分别为16.8、3.6×10⁹ CFU/mL。     

猪大肠埃希菌高密度发酵条件的试验研究

利用5 L发酵罐分批培养O2、O8、O135、O138、O139、O141血清型组成的猪大肠埃希菌菌液,通过活菌计数的方法,对大肠埃希菌在发酵过程中温度、pH、通气量、葡萄糖加量等基本条件进行试验研究.结果表明,在用发酵罐进行大肠埃希菌多个血清型的高密度发酵时,利用常规的干粉培养基,将培养温度控制在37℃±0.5℃,pH控制在7.0～7.2,逐渐增大通气量,根据pH的变化补加40%的葡萄耱,可以使细菌的培养菌数(cfu)达到150亿/mL以上.     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902（K88ac,ST^ ,L^ )的攻击，用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ST1的毒性，这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

Detection of K88 and K99 fimbrial antigens on Escherichia coli by coagglutination

Coagglutination was used to detect K88 and K99 fimbrial antigens on Escherichia coli, and results were compared to an enzyme immuno assay (EIA). When pili suspensions were tested by both methods, 28 of 66 cultures were shown to have K88 and 11 of 31 cultures had K99 antigens. No pili suspensions were positive by coagglutination that were not positive by EIA. Testing of cell suspensions gave equivalent results to pili suspensions for K99 when tested by coagglutination. Two cell suspensions reacted with the K88 coagglutination which could not be confirmed by testing of pili suspensions, while a further 20 out of 43 cultures gave equivalent results with both cell and pili suspensions for K88 when tested by coagglutination.