PCV4 SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型（PCV4）的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×102~5.64×109 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×102 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。     

牛传染性鼻气管炎gE基因TaqMan-MGB与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法，本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物，分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，并对2种方法进行了综合比较。结果显示，TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×10¹ copies/μL和1.0×10² copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性；重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品，2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明，2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。     

猪星状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种能够快速、简便、灵敏地检测猪星状病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据已报道的猪星状病毒ORF2基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增ORF2基因片段,将测序正确的ORF2基因片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪星状病毒荧光定量PCR的标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线特异,灵敏度可达1×101拷贝,是普通PCR检测方法的100倍,特异性和重复性较好。本次建立的猪星状病毒荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、敏感等优点,有重要的实用价值。     

羊口疮病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测羊口疮病毒(ORFV)的方法,基于羊口疮病毒保守序列B2L基因合成一对用于建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的特异性引物,将ORFV B2L全长基因和pMD19-T质粒载体连接,构建重组阳性质粒,以构建的重组质粒DNA作为模板,建立ORFV SYBR Green I实时荧光定量P...     

猪星状病毒4型SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL-1,其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R2=1.00。应用该方法检测了2018-2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。     

猪星状病毒4型SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL~(-1),其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R~2=1.00。应用该方法检测了2018—2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。     

羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α实时荧光定量检测方法的建立

为探讨羊痘病毒感染后机体的凋亡细胞因子mRNA表达水平的变化,深入探讨羊痘病毒免疫机制,本研究设计针对羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α特异性引物,建立羊凋亡细胞因子实时荧光定量方法。分别建立荧光定量PCR反应体系并进行优化。结果表明:Fas、FasL、TNFR1和TNF-α的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰。组内变异系数均小于2.00%。本研究建立的羊凋亡细胞因子SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法为凋亡细胞因子mRNA表达水平提供了技术平台。     

猪细小病毒与猪伪狂犬病毒二重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法的建立与检测

本研究旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪细小病毒与猪伪狂犬病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增PRV gH基因与PPV NS1基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PPV NS1基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.9℃和86.5℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达248拷贝/μL和160拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本次建立的猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PPV混合感染的临床病料进行快速诊断。     

HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

本试验旨在建立一种用SYBR GreenⅠ荧光染料检测HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR mRNA表达水平的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T)15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和熔解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时荧光定量RT-PCR方法,检测FMDV L蛋白对Ⅰ型IFN效应因子的抑制效果。HeLa细胞在转染FMDV L蛋白真核表达质粒,并受到Ⅰ型IFN刺激后ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR的相对表达量较转染空载体或表达GST的真核表达质粒明显降低。本试验建立了HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法,为在mRNA水平上对HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于FMDV L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路的研究中。     

F亚群禽白血病病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测F亚群禽白血病病毒(ALV-F)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,本研究以ALV-F分离株FGD1803基因组为模板,PCR扩增其env基因,构建重组质粒pMD18-T-F作为标准品.利用该重组质粒建立了 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法(qPCR)的标准曲线,并经反应条件优化建立了检测...     

猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及临床样品的检测

采用PCR方法扩增猪细小病毒7型(PPV7)衣壳蛋白基因保守区域493 bp,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒,以其为模板建立用于检测PPV7的SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法,并验证其灵敏性、特异性和重复性。结果表明,本试验建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法在2.85×10^1~2.85×10^8拷贝/μL呈良好的线性关系,相关系数为0.995,斜率为4.158,灵敏度可达到2.85×10^1拷贝/μL。该方法对于猪繁殖障碍性传染病常见病原如PRRSV、PCV2和PRV未出现特异性扩增,表明特异性好。所有标准曲线在溶解温度为83.103℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测了2017年山东地区7家养猪场216份临床样品,总阳性率为12.5%。     

蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平实时定量PCR方法的建立

为了利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术对蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素基因表达水平进行相对定量测定,建立蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平的实时荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中羊β-防御素基因序列设计合成引物,进行实时荧光定量PCR,同时以β-Actin为内参基因对β-防御素基因进行均一化处理,利用荧光阈值(Ct值)计算β-防御素基因的相对表达量.结果表明:扩增产物为β-防御素;利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素基因表达水平相对含量.     

SYBR Green实时荧光定量PCR检测水牛体细胞组蛋白乙酰化相关基因mRNA表达

以检测水牛成纤维细胞中组蛋白乙酰转移酶(HAT1)和脱乙酰化酶(HDAC1)转录活性为例,对SYBRGreen实时荧光定量PCR技术平台的建立进行了探讨.结果显示,适宜的引物,高质量RNA反转录得到的cDNA以及合适的PCR体系为SYBR Green实时荧光定量PCR能否成功的关键因素.本试验中3对引物的灵敏度高,其反应性能完全满足SYBR Green实时荧光定量PCR的要求.2个目的基因HAT1、HDAC1的扩增效率与参照基因H2A接近,试验结果可用2-△△Ct计算法进行分析.当cDNA模板量为0.5 μL(相当于总RNA 50 ng),引物为1 μmol/L时,SYBR Green实时荧光定量PCR能高效获得特异性强的目的产物.     

鸡减蛋综合征病毒Hexon基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测鉴定狮制品

为建立SYBR Green I实时荧光PCR检测鉴定狮（Panthera Leo）制品的方法,本文在豹属动物线粒体细胞色素b基因上设计狮特异性引物,建立并优化了SYBR Green I实时荧光PCR检测鉴定体系,采用17种血液、组织和骨粉类样品的DNA,通过扩增曲线和融解曲线分析检测的特异性和灵敏度,并用狮肉粉和牛肉骨粉系列百分比混合物进行抗干扰能力分析。结果显示,狮血液和组织DNA样品均出现特异性的实时扩增曲线,平均熔解温度在84±0.2℃。虎、豹、熊等14种哺乳动物DNA样本的检测结果均为阴性。灵敏度检测显示,本实验所建立的SYBRGreen I实时荧光PCR方法能够检测出10 pg/μL的狮组分DNA。抗干扰能力显示在骨粉中狮的成分最低检出含量为0.1%。这些结果说明,本文建立的SYBR Green I实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性,可用于狮源性制品的检测鉴定。     

鸭腺病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)一种基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR诊断方法,本试验根据DAdV-3基因组序列中相对保守的Fiber-2基因,通过普通PCR扩增,构建pMD19-Fiber2重组质粒为阳性标准品,在此基础上设计合成特异性引物进行实时荧光定量PCR方法的建立,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,针对DAdV-3的Fiber-2基因建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法线性关系良好,相关系数0.998 9;检测DAdV-3的灵敏度为3.6×10² copies/μL,敏感性比普通PCR检测方法高100倍;该方法对鸭腺病毒1型、鸭疫里默杆菌等其他常见病原均无交叉扩增反应,批内、批间变异系数均小于5%;临床样本检测与普通PCR符合率100%。以上结果表明,所建方法特异性强、敏感性高且重复性好,适用于临床检测,该方法可为DAdV-3的临床诊断、流行病学调查以及防控提供技术支持。     

PRRSV、PCV2与CSFV多重SYBRGreenⅠ实时荧光PCR检测方法的建立与初步应用

旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)与猪瘟病毒(CSFV)3种病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了3对引物分别用于扩增PRRSV ORF7基因、PCV2ORF2基因与CSFV 5′端保守序列的部分片段。将测序正确的3段基因片段分别克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,PCV2、PRRSV与CSFV荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为84.6、86.7、89.3℃,溶解曲线特异,灵敏度分别可达181、202、177拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本试验建立的PRRSV、PCV2与CSFV的荧光定量PCR检测方法实现了3种病毒的同时检测,能够对PRRSV、PCV2、CSFV混合感染的临床病料进行快速诊断。     

猪源干扰素刺激基因PPBP荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据猪源干扰素刺激基因PPBP(pro-platelet basic protein)基因全长序列,使用引物设计软件Primer Premier5.0设计合成特异性引物,经过PCR扩增,将基因扩增的片段连接到相应的载体上,成功构建重组质粒p3XFLAG-CMV-7.1-PPBP。重组质粒经过筛选、鉴定以及纯化后,经10倍系列稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中PPBP标准曲线的构建,并检测重复性、灵敏性和特异性。结果显示标准曲线线性关系R20.99;特异性试验中也能检测到PPBP扩增曲线;组间和组内变异系数均小于5%。使用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测PRRSV感染组织和未感染组织中PPBP的表达情况,能够检测出组织中PPBP的含量存在差异。本研究初步建立了检测猪PPBP基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为后续猪传染性疾病和猪PPBP之间相互关系的研究提供一个特异灵敏的检测和手段。     

犬瘟热病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。     

检测鼻气管鸟疫杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立

利用DNAStar对GenBank上发布的鼻气管鸟杆菌(ORT)16S rRNA基因进行序列分析,根据分析结果选择其保守区域设计1对特异性的引物。扩增16SRNA部分保守基因序列并将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,经鉴定、纯化后作为阳性标准品,用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线的建立。反应条件反复优化后,成功建立了检测ORT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法对ORT的最低检测量约为100拷贝数/μL,比普通PCR高100倍;与引起禽类呼吸系统疾病的其他病原体之间无交叉反应;批内和批间试验的变异系数均小于0.63%,充分显示该方法具有良好的重复性和稳定性。对46份临床样本进行ORT检测,该方法检测的阳性样本为38份,检出率为82.26%。在38份阳性样品中,普通PCR只检出30份阳性样品,常规细菌培养只检出23份阳性样品。结果表明:本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法比其他方法更敏感,为临床上快速准确的检测、诊断禽类ORT的感染提供了敏感可靠的检测方法。