梨花粉自交不亲和基因克隆及其评价分析

【目的】获得梨SFBB新基因全长序列,研究不同SFBB基因参与梨自交不亲和的作用。【方法】设计特异性引物扩增梨SFBB22-gamma基因组DNA全长序列,并对所有已鉴定、能够与梨S-RNase基因一一对应的SFBB基因全长序列进行比较分析。【结果】梨SFBB22-gamma基因编码区序列大小为1191 bp,编码396个氨基酸,ProtParam预测分子质量为45.47 ku,理论等电点4.67,为酸性亲水不稳定蛋白。其中N端包含由50个氨基酸组成的F-box序列,蛋白质二级结构有5个α-螺旋和24个β-折叠。不同梨SFBB基因和对应S-RNase基因在序列变异、基因多态性以及进化特性等方面存在差异。【结论】现有序列数据显示,梨SFBB基因的序列多态性和变异位点均小于S-RNase。梨SFBB基因4个群体中单个群体SFBB-beta基因和对应S-RNase基因在序列特征上最接近;4个梨SFBB基因个体作为整体与对应S-RNase基因序列特征比SFBB-beta基因和对应S-RNase基因序列特征更接近。SFBB-beta基因存在独自参与自交不亲和的可能性,SFBB-alpha以及SF...     

苹果LysM类受体激酶基因家族鉴定与表达分析

以LysM(PF01476)和Pkinase(PF00069)保守域全蛋白序列为种子序列,在全基因组范围比对分析了苹果(Malus×domestica Borkh.)LysM-RLK家族的成员,对其家族成员的理化性质、进化关系、染色体分布、基因结构等进行了分析;基于已公布的转录组学数据,分析了LysM-RLK基因在苹果组织、发育过程和生物胁迫中的表达情况。通过分析,共获得12个苹果LysM-RLK基因,其氨基酸序列大小介于553~1 053,分子量介于62.65~119.04 kD,等电点介于5.11~7.45,主要位于质膜;根据进化分析将其分为3个亚组,亚组内各成员的外显子—内含子结构呈现较为相似的特征。基因表达数据显示,苹果的4个LysM-RLK基因表达存在较大的组织特异性,7个基因在苹果腐烂病和再植病发病过程中为差异表达。     

香菇乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶编码基因le-pyrG的克隆

通过巢式简并PCR和基因组步行技术从香菇(Lentinula edodes)单核体中克隆到乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶(orotidine-5'-monophosphate decarboxylase,OMPDC)的编码基因le-pyrG,长度为946 bp.经生物信息学分析,香菇le-pyrG基因含有2个长度分别为67 bp和51 bp的内含子,该基因可以编码1个含有275个氨基酸残基的蛋白质序列,该序列经比对分析显示与裂褶菌(Schizophyllum commne)和灰盖鬼伞(Coprinus cinereus) OMPDC序列的相同性分别为73%和70%,相似性分别为84% 和83%.这是首次报道从栽培食用真菌中克隆出乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶编码基因的全序列.     

香菇血红素过氧化物酶基因克隆及表达分析

对香菇(Lentinula edodes)血红素过氧化物酶(heme peroxidase,LeHP)基因进行鉴定、生物信息学分析和克隆,并通过荧定量PCR研究各LeHP基因在香菇采后贮藏期间的表达情况.结果表明:香菇中含有3个LeHP基因,编码序列长度为3165～3240 bp,编码1055～1089个氨基酸;所有L...     

2个中亚杏S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆中亚杏(Prunus armeniaca)品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列,为分子手段调控杏自交不亲和性状奠定基础。【方法】以新疆栽培杏品种‘索格佳娜丽’和‘赛买提’为试材,利用RT-PCR克隆2个品种的花柱SRNase基因c DNA片段,RACE技术进行c DNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam软件分析2个基因的编码蛋白特性,MEGA 5.0构建进化树。【结果】从‘索格佳娜丽’中克隆了S_(52)-RNase(KF951503)基因,从‘赛买提’中克隆了一个新的S_(53)-RNase(KF975455)基因DNA和c DNA全长序列。S_(52)-RNase的DNA全长2 200 bp,c DNA全长765 bp,ORF(开放阅读框)长681 bp,编码226个氨基酸;S_(53)-RNase的DNA全长1 664 bp,c DNA全长907 bp,ORF长732 bp,编码242个氨基酸。BLASTP比对显示:这2个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为26.5 ku和27.5 ku,等电点为9.36和9.03,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,S_(52)与李(Prunus salicina,S_7)、S_(53)与大岛樱(Prunus speciosa,S_(13))亲缘关系最近,S_(52)和S_(53)处在2个不同的分支上,表现出较高的序列多态性,表明2个基因亲缘关系较远。【结论】获得了2个中亚杏品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列。     

具有蛋白酶体β7亚基功能的棉铃虫HaProβ7基因的克隆与序列结构及表达研究

以棉铃虫中肠总RNA为模板,利用快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了棉铃虫蛋白酶体β7亚基基因的cDNA序列,并对所得基因进行了序列分析。结果表明:棉铃虫蛋白酶体β7亚基基因的cDNA序列亚基全长1 007 bp,命名为HaProβ7(GeneBank登陆号:FJ378902),包含1个846 bp的完整开放读码框(ORF)序列,编码蛋白质为281个氨基酸残基,预测分子量30.07 kD,等电点为8.04。HaProβ7蛋白质在40～229氨基酸残基位置为蛋白酶体β7亚基的保守区域。Clustal W进行多序列比对发现,HaProβ7编码蛋白质与果蝇等昆虫蛋白酶体β7具有63%以上的同源性,蛋白酶体β7的保守区域高度一致。邻近(NJ)法分子进化分析也显示,HaProβ7编码蛋白质与其它生物蛋白酶体β7进化上同源。基因表达谱分析结果表明,Haproβ7在体壁、中肠和生殖腺中表达量较高,在头部表达量最少。     

白菜S位点糖蛋白基因的克隆与表达分析

 以白菜自交不亲和系为材料,采用RT-PCR技术,用特异引物对SLG基因进行克隆,获得SLG基因cDNA序列长度为1 324 bp,命名为BcSLG。序列分析表明：所获得的白菜BcSLG基因cDNA序列包含一完整的编码框,编码432个氨基酸,含有12个保守的半胱氨酸残基和7个N-糖基化位点。序列比对和系统进化分析表明：BcSLG与其它植物的SLG基因氨基酸序列具有较高的同源性,与大白菜和甘蓝亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明：BcSLG基因在自交不亲和系的柱头中表达量最高,其次是花蕾,叶片中表达最低, 在自交亲和系的柱头、花蕾和叶片中相对表达较低。     

欧李自交不亲和S-RNase基因型鉴定及序列分析

以欧李4个品种为试验材料,采用同源克隆的试验方法,克隆S-RNase基因并分析其序列特征,确定不同品种基因型,以期为欧李杂交育种亲本选择提供参考依据。结果表明:克隆鉴定得到5个新的S-RNase基因,编码氨基酸168～172个,相对分子质量为19.87～20.34 kDa,等电点(PI)为9.60～9.73,以丝氨酸磷酸化为主;二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主;同源性比对和结构分析表明,5个新的S-RNase均属于RNase T2基因家族,推导的氨基酸序列包含5个保守区(C1、C2、C3、RC4和C5)和1个高变区(HV),具有与李属、梨属、苹果属S-RNase相似的保守结构;进化分析显示欧李S-RNase与李属果树S-RNase聚类在一起,亲缘关系较近。     

莲种子防御素基因序列分析及表达载体构建

从莲种子发育中期胚cDNA文库中克隆得到的防御素基因cDNA全长561bp,GenBank登录号为EF421192。分析发现该基因234bp的开放读码框编码77个氨基酸的多肽序列,除信号肽序列外与其它不同来源的植物防御素基因有较高同源性,将其命名为NnDefensin。NnDefensin蛋白带有30个氨基酸的信号肽,具有8个半胱氨酸的高度保守结构等典型的植物防御素特征,成熟肽部分含有γ–硫素蛋白功能结构域。在系统进化上NnDefensin与单子叶植物中的粳稻和小麦的同源蛋白,以及车前草同源蛋白亲缘关系较为接近。通过PCR扩增克隆莲胚防御素基因片段并连接到载体pBI121和带有花生油体蛋白种子特异启动子的载体pAhOleo17.8︰GUS中,成功构建了35S启动子控制的植物表达双元载体pBI121-NnDef和种子特异表达双元载体pAhOleo-NnDef,为该基因的功能鉴定及通过基因工程方法提高转基因植物以及种子的抗病能力奠定基础。     

香菇编码线粒体中间肽酶le-mip基因及其紧密连锁基因的克隆

根据香菇(Lentinula edodes)编码线粒体中间肽酶le-mip基因的保守序列,通过基因组步行法对le-mip基因及其上游、下游区域进行步行扩增,扩增产物经SeqMan程序拼接后再BlastX搜索,并进行同源性分析.所获得的序列长8 880 bp,其中有5个推定的基因,且与le-mip紧密连锁的基因中没有香菇的A交配型基因.     

甜菜蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及序列分析

甜菜蔗糖磷酸合成酶（Beta vulgaris sucrose phosphate synthase,BvSPS）是甜菜体内控制蔗糖合成的关键酶之一。根据Genbank上的BvSPS序列（Genbank accession no.X X81975）,利用RT-PCR方法,从甜菜体内扩增获得了BvSPS基因的cDNA全长,并将其连接到pMD 18-T载体上。通过利用PstI、XbaI和EcoRI对重组质粒pMD 18-T-BvSPS进行酶切鉴定,进一步确定了重组质粒的正确性。利用生物信息学软件分析结果表明,该基因cDNA全长为3138bp,编码1045个氨基酸,蛋白质分子量为118.18kDa,等电点为6.15,该蛋白被预测定位于细胞核内。     

3种鲜销香菇子实体蛋白质营养价值评价

测定了福建省3个菌株、适宜鲜销的香菇(Lentinus edodes)子实体蛋白质含量、氨基酸含量及其种类,应用化学评分法、氨基酸评分、模糊评价法等6种国际通用的非生物学蛋白质评价方法,对3个香菇菌株的营养价值进行综合评价。结果表明,3个香菇菌株蛋白质含量分别为20.6%、21.4%、24.6%,2号香菇菌株氨基酸总量和必需氨基酸总量均为最高,分别为16.53%和6.52%;3个香菇菌株均富含谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸等氨基酸,含量较丰富的必需氨基酸为苯丙氨酸和酪氨酸,亮氨酸和赖氨酸,3个香菇菌株的第一限制氨基酸相同,均为为蛋氨酸和胱氨酸。化学评分分别为63.92、63.75、63.44;氨基酸评分分别为82.01、79.51、82.44;3个品种香菇与标准蛋白(全鸡蛋模式)的贴近度分别为0.92、0.92、0.91。     

茄子花青素合成中SmTTG1、SmGL3和SmTT8的表达及其蛋白质间的相互作用

采用同源克隆方法从茄子（Solanum melongena L.）中分离得到3个基因,分别命名为SmTTG1、SmGL3和SmTT8。序列分析表明,SmTTG1的cDNA全长1 220 bp,开放阅读框为1 029 bp,编码342个氨基酸,与马铃薯（S. tuberosum L.）TTG1基因序列同源性达到94%,成熟蛋白等电点为4.90,具有典型的WD结构域;SmGL3的cDNA全长2 329 bp,开放阅读框为1 887 bp,编码628个氨基酸,与马铃薯GL3基因序列相似性达到94%,蛋白等电点为5.61,有典型的HLH结构域;SmTT8的cDNA全长2 242 bp,开放阅读框为1 896 bp,编码631个氨基酸,与马铃薯TT8基因序列同源性为85%,蛋白等电点为5.18,有典型的HLH结构域。荧光定量检测结果表明,SmTTG1、SmGL3和SmTT8在茄子根、茎、叶、花、果皮和果肉中均有表达,但表达水平具有组织特异性。酵母双杂交结果表明,SmTTG1与SmTT8、SmGL3之间有相互作用,并且SmTTG1、SmGL3和SmTT8都与SmMYB之间发生作用。推测SmTTG1为WD40转录因子,SmGL3和SmTT8为bHLH转录因子,它们都参与调控茄子花青素的合成。     

枯草芽孢杆菌代谢产物对香菇生长的影响

以枯草芽孢杆菌KD1发酵代谢产物为试材,采用统计分析及食品分析检测等方法,研究KD1发酵代谢产物对香菇菌丝生长、子实体性状、香菇产量以及香菇营养成分的影响,并探究该代谢产物的储存稳定性。结果表明:相比于对照组,KD1发酵代谢产物对菌丝生长速度最大提升率达9.64%,同时显著改良子实体性状;在产量方面,前4批次总出菇量提升18.59%,最大单潮香菇产量提升35.40%;在营养成分方面,丰富了香菇中游离氨基酸含量和种类,香菇中游离必需氨基酸总量提升38.46%,新增亮氨酸和异亮氨酸2种氨基酸;且代谢产物在室温下可长期稳定保存。综上所述,KD1发酵代谢产物应用于香菇生产具有巨大潜力与广阔发展前景。     

甜瓜中甜菜碱醛脱氢酶基因CmBADH的克隆及非生物胁迫下的表达分析

 以甜瓜（Cucumis melo L.）‘TS-2’为材料,根据GenBank 登录的植物甜菜碱醛脱氢酶氨基 酸保守序列设计兼并引物,利用RT-PCR 和3′、5′RACE 技术从甜瓜叶片中克隆到1 个甜菜碱醛脱氢酶基 因,命名为CmBADH,在GenBank 中的注册号为：JN091961.1。生物信息学分析表明,该基因全长1 856 bp, 编码503 个氨基酸,BADH 蛋白大小约54 kD,理论pI 为5.182。甜瓜BADH 蛋白与麻疯树同源性最高, 为82.96%。该基因编码蛋白有4 个强的跨膜螺旋结构。PlantCare 分析结果显示该基因序列具有茉莉酸甲 酯、防御与胁迫、玉米醇蛋白代谢途径、低温、光响应、分生组织表达、生理周期调控等顺式作用元件 和干旱诱导的MYB 结合位点。实时荧光定量PCR 表明,CmBADH 受盐、干旱、低温、高温诱导,其表 达均呈现先上升后下降的趋势;CmBADH 还随外源ABA 诱导时间的延长呈现上升表达的趋势。     

结球甘蓝花粉蛋白延伸因子基因的克隆及其序列分析

 以结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）E1花粉为试材,对萌发前后的花粉总蛋白进行双向电泳及差异蛋白质谱分析,发现延伸因子BoEF-Tu蛋白在花粉萌发后较萌发前表达上调。利用同源克隆得到甘蓝BoEF-Tu基因的全长cDNA序列,其长度为1 728 bp,具有一个完整开放阅读框（ORF）,位于112 ~ 1 473 bp处,编码453个氨基酸残基,预测分子量为49.17 kD,等电点为6.52。生物信息学分析表明：BoEF-Tu蛋白含有9个α–螺旋结构,18个β–折叠结构,不含信号肽和跨膜区,在106 ~ 121位氨基酸残基处有1个GTP结合区域（DKAPEEKKRGITIATA）。氨基酸同源性分析表明,BoEF-Tu与拟南芥EF-TuM同源性较高,达到93%;系统进化分析表明,BoEF-Tu与拟南芥EF-Tu的亲缘关系最近。     

荔枝FLOWERING LOCUST(FT)同源基因cDNA全长克隆及其表达

应用RT-PCR方法在首次克隆获得荔枝AP1同源基因cDNA全长基础上,又得到2个荔枝FT同源基因cDNA全长,分别命名为LcFT1和LcFT2(基因登录号分别为:JN214350、JN214351)。LcFT1基因开放阅读框522 bp,编码174个氨基酸,推测蛋白质分子质量为19.65 ku,等电点为8.68。LcFT2基因开放阅读框522 bp,编码174个氨基酸,推测蛋白质分子质量为19.56 ku,等电点为7.34。蛋白质二级结构预测表明,LcFT1和LcFT2蛋白都具有4个α螺旋,10个β折叠区。同源分析表明,LcFT1和LcFT2基因在不同植物中的一致性为72%～82%。半定量RT-PCR分析表明,三月红荔枝花芽分化期LcFT1和LcFT2基因只在叶中表达,并且在成熟叶中表达量最多。研究将有助于进一步了解荔枝开花的分子机理及其成花的生物学发育过程。     

普通白菜1，5- 二磷酸核酮糖羧化/ 加氧酶小亚基基因BcrbcS 的克隆及表达分析

利用RACE 技术,从普通白菜抗霜霉病品种苏州青叶片克隆到1,5- 二磷酸核酮糖羧化/ 加氧酶小亚基（ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit,BcrbcS）基因的全长cDNA 序列。采用qRT-PCR 分析该基因在普通白菜不 同组织的表达模式。利用SDS-PAGE 技术分析了该基因的原核表达特征。序列分析结果表明,BcrbcS 基因的cDNA 序列全 长为733 bp,其中开放阅读框长度为543 bp,共编码181 个氨基酸,分子质量为20.3×10³ Da,理论等电点为8.23。氨基酸 同源系统进化分析表明,普通白菜BcrbcS 基因与同科植物的进化关系相近。实时定量分析结果表明,BcrbcS 基因在普通白 菜叶中表达最强;在SA 和NaCl 处理下,BcrbcS 基因表达量均在处理24 h 后达到峰值。原核表达载体经IPTG 诱导表达出分 子质量约为20×10³ Da 的融合蛋白。     

7株野生香菇菌株的特性及出菇试验

为了挖掘优质的种质资源,从香菇发源地浙江龙泉凤阳山采集分离到7株野生香菇(Lentinus edodes)菌株,ITS序列分析鉴定确定为香菇菌株,并且7株野生香菇之间具有遗传差异性。在菌株的特性和出菇试验中,菌株YS1的菌丝生长最快,菌株YS7的木质素酶活性和纤维素酶活性都相对较高,菌株YS2的抗木霉能力强,菌株YS5出菇耐低温,以上菌株可以用于进一步研究、开发、驯化,以培育出优质的香菇栽培菌种。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。