表达MDVgB基因重组痘苗病毒的构建及保护性研究

以脂质体转染技术构建了表达鸡马立克氏病毒(MDV)gB基因的重组痘苗病毒(RVV-gB), 表明该病毒在CV-1(猴肾细胞)细胞系内能稳定传代,经腹腔1×106 PFU·羽 -1 将重组病毒、HVT冻干苗及痘苗病毒分别按试验程序,免疫1日龄SPF鸡,并于15日龄以3×10 2PFU·羽-1MDV强毒株GA株攻毒,重组病毒和HVT冻干苗匀获得较高的保护, 结果证明了gB是MDV的宿主保护性抗原.此研究为CTL应答检测奠定了基础.     

马立克氏病病毒gB基因的重组痘苗质粒构建

根据马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ｇＢ基因序列设计ＰＣＲ引物,以ｇＢ质粒为模板,扩增出ＭＤＶｇＢ基因５’端到３’端３８８ｂｐ的ＤＮＡ片段。用ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶消化ＰＣＲ产物,将其克隆入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒,构建中间质粒Ⅰ;用ＸｂａⅠ消化ｇＢ质粒,切出ＭＤＶｇＢ基因ＸｂａⅠ片段,并正向克隆入中间质粒Ⅰ的ＸｂａⅠ位点,将ＭＤＶｇＢ基因１３７ｂｐ的ＰＣＲ产物与其ＸｂａⅠ片段正向连接,构建中间质粒Ⅱ用ＥｃｏＲⅠ调出中间质粒Ⅱ中的ＭＤＶｇＢ基因,正向克隆入痘苗病毒表达载体ｐ１６启动子下游,构建ＭＤＶｇＢ基因表达质粒ｐ１６－ＭＤＶｇＢＭＤＶｇＢ基因重组痘苗表达质粒的成功构建,为下一步进行重组病毒的构建及ＣＴＬ应答的深入研究奠定了基础     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

MDV-gB重组痘苗病毒诱导的免疫保护性试验

用MDV-gB重组痘苗病毒RVV-gB，HVT冻干苗、痘苗病毒WR株分别按试验程序，对细胞免疫及体液免疫检测试验中的1日龄SPF鸡进行免疫接种，并于15日龄对各组小鸡攻GA株强毒，后经过IFA检测抗体，以及以PHA为有丝分裂原检测淋巴C转化。结果表明，重组病毒和HVT冻干苗均获得较高保护，体液免疫差异不显著；细胞免疫在攻毒前差异不显著，但攻毒后第2d开始，RVV-gB组淋巴细胞转化率明显高于HVT冻干苗。?     

TK基因重组缺陷山羊痘病毒构建及其生物学特性鉴定

[目的]利用同源重组技术构建TK基因缺陷的山羊痘病毒（GTPV）毒株,为研制出更安全、高效的GTPV弱毒疫苗和病毒载体提供备选毒株.[方法]采用PCR克隆GTPV AV41株TK基因（ORF56）及其侧翼基因组片段,在TK基因内部插入报告基因EGFP抗性基因gpt达盒,构建GTPV重组转移载体pTK-Eg.将重组转移载体pTK-Eg与GTPV AV41株共转染Vero细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,鉴定其生长特性和遗传稳定性,并接种山羊评价其安全性和免疫原性.[结果]成功构建获得一株TK基因缺陷的重组病毒vTK-Eg.与亲本毒株GTPV AV41相比,vTK-Eg的生长特性及其形成的细胞病变均未发生显著改变,只是毒价略微下降100.5个数量级;在原代牛睾丸（BT）细胞上连续传代,至少在10代内保持遗传性状和病毒滴度稳定.接种vTK-Eg的山羊精神和食欲均正常,接种后体温升高和局部反应的严重程度均较接种亲本毒株GTPV AV41的山羊有所降低;vTK-Eg与GTPV AV41株诱导山羊产生的GTPV中和抗体水平无明显差异（P＞0.05）.[结论]构建的TK基因重组缺陷病毒vTK-Eg具有良好的遗传稳定性和免疫原性,较亲本毒株其安全性也有所提高,可作为研制GTPV基因工程弱毒疫苗和活载体疫苗的备选毒株.     

表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×1010.mL-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。     

猪瘟病毒生物学特性研究概述

阐述了猪瘟病毒与机体免疫系统的相互作用、在哺乳动物细胞中的增殖特点、与毒力相关基因的预测。概括了世界猪瘟病毒的基因分型、不同基因型毒株的分布情况和流行病学,分析了病毒的遗传变异特点与疫苗免疫前景,讨论了消灭猪瘟要面临的问题。     

马铃薯M病毒生物学特性研究

测定马铃薯M病毒(Potato virus M,PVM)寄主范围,并作PVM接种条件优化试验。结果表明,PVM仅侵染15种指示植物中的4种,各种植物症状表现不同。苋色黎(Chenopodium amaranticolor)和千日红(Gomphrena globosa L.)接种叶片上产生枯斑,可作为PVM枯斑寄主;36号烟(Nicotiana occidentalis"pi")系统发病,新生叶片产生皱缩、泡斑、叶边缘卷曲等症状,植株长势矮小,可作为PVM系统侵染鉴定寄主;PVM系统侵染番茄(Lycopersicon pimpinellifolium)速度快,但无症状,番茄可作为PVM繁殖寄主。PVM虽可侵染不同生育期寄主,以接种中上部叶位侵染效果最好,但在不同寄主不同叶位分布并不一致,番茄体内中部叶片病毒含量相对较高,在苋色黎上则分布较均匀。明确PVM最适培养温度为23~29℃。最高稀释度64倍时(OD405=0.201)仍可成功侵染苋色黎。为PVM纯毒源扩繁及制备该病毒抗血清提供基础数据。     

北京3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

[目的]为了解2000年北京地区H9N2分离毒株的遗传特点。[方法]采用RT-PCR技术扩增了3株H9N2亚型禽流感病毒北京地区分离株的HA基因片段,并对所得序列进行分析比较。[结果]遗传演化分析表明,所分离的3个毒株的HA基因与其他中国内地和香港毒株的同源性分别为XU株84.8%（Dk/HK/Y439/97）～98%（Ck/GX17/00）,LIU株85.1%（Dk/HK/Y439/97）～99.1%（Ck/GX17/00）,BEI株90.7%（Ck/BJ/3/01）～99.1%（Ck/GX17/00）。氨基酸序列分析发现,3株病毒均为禽源低致病力毒株,226位氨基酸均为L（Leu）,更易于与人类细胞结合;HA蛋白存在7个糖基化位点。[结论]从分子水平分析,A/Chicken/Beijing/xu/00、A/Chicken/Beijing/bei/00和A/Chicken/Beijing/liu/00株属于低致病力的H9N2亚型禽源毒株。     

表达带His-tag的禽流感病毒HA基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A／Goose／GuangDong／1／96（H5N1）1．7kb HA基因的eDNA将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis4．5，筛选到重组质粒命名为rpBacHisH5HA。测序正确后，在脂质体介导下，与线性化的杆状病毒ENA（Bac-N-Blue TMDNA）共转染Sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rBacHisH5HA。提取重组病毒DNA经PCR证明目的基因片段已插入杆状病毒基因组。     

免疫鸡群马立克氏病病毒分离物的生物学特性

本实验在对内蒙古呼和浩特和包头的７个鸡场进行ＭＤ流行情况调查的基础上，通过病毒分离实验，首次自内蒙古呼和浩特、包头地区经ＭＤ疫苗免疫过的５个发病鸡群和１个健康鸡群中分离到６株马立克氏病毒（分别命名为ＨＡ、ＨＢ、ＨＣ、ＨＥ、ＨＦ和ＢＧ），并对６株病毒在鸡胚成纤维细胞（ＥＦ）上的增殖特性、蚀斑形成、形态和毒力等生物学特性进行了鉴定。结果表明，ＭＤ在呼和浩特、包头地区鸡群中广泛流行。自然感染鸡羽囊中ＭＤＶ抗原与病毒血症呈正相关。雏鸡接种法和组织培养法用于分离ＭＤＶ时，敏感性无显著差异。应用ＣＥＦ分离ＭＤＶ是１种快速、简便、敏感、经济的方法；６株ＭＤＶ在ＣＥＦ上能良好地增殖，并引起比较规则的细胞病变，还能在ＣＥＦ上产生圆形或椭圆形的小细胞蚀斑、大小为１．０８～１．４２ｍｍ。６株ＭＤＶ对雏鸡均有致病性，其中ＨＢ、ＨＥ、ＨＦ和ＢＧ４株之间毒力差异显著，ＨＢ和ＢＧ株的毒力比京—１株ＭＤＶ强。根据以上结果判定６株ＭＤＶ均属血清Ⅰ型ＭＤＶ强毒。结合接种雏鸡的病理学检查结果确定，ＨＡ、ＨＢ、和ＨＥ为内脏型ＭＤＶ，属Ⅰ生物组；ＨＣ、ＨＦ和ＢＧ为神经型ＭＤＶ，属Ⅱ生物组。     

H5N1禽流感病毒HA基因的重组腺病毒表达载体的构建

采用PCR方法扩增出禽流感病毒HA基因,将其定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中构建pAdtrack-H5,之后将pAdtrack-H5与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-H5,将pAdeasyd-H5经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞株,包装出含有HA基因的腺病毒pAd-H5。结果表明:含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-H5和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-H5经PCR、双酶切及核苷酸测序鉴定无误。包装成功的腺病毒pAd-H5经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。     

一株H9(N2)型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出禽流感病毒(H9亚型)血凝素的cDNA。通过T-A连接将已加A尾的PCR产物连接到线状克隆载体pGEM-Teasy vector,转化J M109感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆。经PCR扩增,进一步确证为目的片段。对目的片段进行测序,结果获得该毒株的HA基因全长。与已知序列进行同源性比较,同源性最高的可达98%,表明这些分离株的亲缘关系较近;系统发育分析表明,该毒株属欧亚种系;通过血凝素裂解位点的氨基酸序列分析可知,该分离株的HA切割位点上未见到典型的高致病力毒株H5、H7所具有的一系列碱性氨基酸,其排列顺序为-PARSSRGLF-。所克隆的基因为禽流感病毒HA基因芯片的研究奠定了基础,同时为诊断和预防AI提供了理论依据。     

荧光蛋白标记表达H6亚型禽流感病毒血凝素基因

研究构建了H6N2亚型AIV的核酸疫苗表达载体,以绿色荧光蛋白基因作为报告基因,构建了HA与报告基因的融合基因,并克隆于pAVX1表达载体,再经脂质体转染BHK细胞进行体外表达试验.构建的表达载体pAVX1-H6A-GFP酶切鉴定已克隆上融合基因;体外表达试验中,脂质体转染24 h后出现微弱荧光,48 h后见较强的荧光表达,从而成功实现了用荧光蛋白标记表达了H6亚型禽流感病毒血凝素基因.     

H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白225位氨基酸对病毒致病性的影响

[目的]流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的,笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后,病毒对小鼠的致病性发生了改变.通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点,为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础.[方法]对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对,确认氨基酸...     

纳豆菌生物学特性研究

研究了不同温度、pH值、培养时间、通气量、接种量、盐浓度因素对纳豆菌生长的影响,试验结果表明,该菌种生长适宜条件为：温度30-45℃;通风,转速140r／min,500mL三角瓶装液量100mL;pH值7．0;培养时间24h;接种量2％-5％。纳豆菌耐盐性较强,在含盐量8％的条件下仍能较好生长。     

H5亚型AIV HA和HA1的Sf-9昆虫细胞表达及其作为检测抗原的初步比较分析

利用杆状病毒表达系统,在昆虫细胞Sf-9中分别表达了H5亚型禽流感病毒的HA、HA1。相同表达条件下,Western Blot分析比较表明,HA、HA1均与H5亚型AIV抗血清反应,且不与H7、H9亚型AIV抗血清发生交叉反应,具有良好的特异性;以Western Blot检测鸡、鸭AIV抗血清,初步表明,重组杆状病毒表达的HA、HA1均可作为H5亚型AIV血清检测的抗原,HA优于HA1。