牦牛大肠埃希氏菌的肠毒素试验

从自然病死牦牛体内分离出3株大肠埃希氏,用改良Mundell产毒液体培养基分别培养,培养物经高速离心,过滤,使用滤液做兔回肠结扎试验,乳鼠灌胃试验和大鼠回肠环袢试验.结果表明3株大肠埃希氏菌均产生肠毒素,阐明了牦牛腹泻的病因.     

产肠毒素大肠埃希菌主要黏附素的研究进展

产肠毒素大肠埃希菌的主要黏附素抗原有K88、K99、987P和F41,在发病学和免疫学上扮演着重要的作用.文章就其理化特性、生物学特性、分子生物学特性及主要检测方法进行综述.     

大肠埃希菌不耐热肠毒素研究进展

大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT)是产毒性大肠埃希菌产生的一种能导致人畜腹泻的毒素,由六聚体蛋白形成AB5型结构.A亚基具有ADP核糖基转移酶活性,而B亚基为五聚体,主要与表达于真核细胞表面的神经节苷脂GM1结合.LT具有很强的免疫原性和黏膜免疫佐剂活性.为了将其毒性与佐剂活性分开,研究者构建了一系列无毒或减毒的突变体.证明突变体具有佐剂活性,并发现没有毒性的AB复合物以及酶活性在佐剂活性中发挥的作用是分开的.野生型LT、LT突变体以及B亚基与外源抗原共同免疫机体后,对机体免疫系统具有调节作用.     

大肠埃希菌不耐热肠毒素作为黏膜免疫佐剂的研究进展

免疫佐剂是一类通过刺激机体免疫系统而非特异性地增强机体对抗原免疫应答的活性物质,也是近年来研究的热点.免疫佐剂种类众多,利用细菌及其代谢产物作为黏膜免疫佐剂具有很好的发展前景,研究较多的是霍乱毒素(CT)和大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT),从研究效果看,LT比CT更为理想.但是LT和CT一样本身具有毒性,这是其作为黏膜佐剂的主要缺点.目前,国内外研究工作者对其突变体做了大量研究,以期找到具有黏膜佐剂活性但低毒或无毒的大肠埃希菌不耐热肠毒素突变体.文章对大肠埃希菌不耐热肠毒素分子及其突变体的研究做一综述.     

大肠埃希菌耐药机制研究进展

长期以来,人们对大肠埃希菌病的防治以药物控制为主要手段,但是随着抗菌药的长期大量使用,导致了大肠埃希菌耐药性的产生,给大肠埃希菌病的防治带来严重的障碍,通过对大肠埃希菌耐药性的现状、作用机理、主要特点、对人类的危害和防治策略等方面的研究,进一步提出对大肠埃希菌耐药性的展望,为消除大肠埃希菌的耐药性,更好地防治大肠埃希菌病提供科学依据。     

大肠埃希菌耐药机制研究进展

大肠埃希菌在自然界中广泛存在,在一定的条件下可以引起畜禽患病,在长期治疗过程中,由于药物的选择压力可以引起其对药物的抗性,而且耐药广泛、耐药机制复杂,给疾病临床治疗带来了一定的困难。大肠埃希菌耐药机制主要包括细胞膜通透性改变、细菌产生灭活酶或者钝化酶、靶点结构改变、主动外排泵、质粒介导的大肠埃希菌耐药等。论文介绍了我国部分地区畜牧业中大肠埃希菌耐药现状、大肠埃希菌耐药机制以及应对大肠埃希菌耐药的策略,以便了解耐药大肠埃希菌的传播特点,为防治大肠埃希菌耐药性产生和临床治疗大肠埃希菌感染提供一定的理论指导。     

产肠毒素大肠埃希茵主要黏附素的研究进展

产肠毒素大肠埃希茵的主要黏附素抗原有K88、K99、987P和F41，在发病学和免疫学上扮演着重要的作用。文章就其理化特性、生物学特性、分子生物学特性及主要检测方法进行综述。     

牦牛大肠埃杀氏菌的肠毒素试验

从自然病死牦牛体内分离出3株大肠埃杀氏，用改良Mundell产毒液体培养基分别培养，培养物经高速离心，过渡，使用滤液做兔回肠结扎试验，乳鼠灌胃试验和大鼠回肠环袢试验，结果表明3株大肠埃杀氏菌均产生肠毒素，阐明了牦牛腹泻的病因。     

大肠杆菌热敏毒素研究概况

本文在分析大肠杆菌热敏毒素（LT）生物学特性及其分子学水平研究的基础上，从蛋白质和基因水平阐述了猪源LT与人源LT的亲缘关系，评述了LT在研制人畜大肠杆菌腹泻疫苗中的应用价值，也通过对与LT具有相似蛋白和基因结构的霍乱毒素CT的分析，表明二者具有相同的进化起源，认为通过定点诱变的LT能够取代CT用作幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂。     

猪圆环病毒2型Cap 蛋白部分基因序列与大肠杆菌LTB成熟肽基因的融合表达及免疫原性研究

为了获得猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)衣壳蛋白(Cap)基因3’端396 bp的片段与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)成熟肽编码区融合基因的高效表达,并检验重组蛋白的免疫保护效果。以含PCV-2全基因组的pMDT PCV-2质粒为模板,用PCR的方法扩增PCV-2 Cap基因,并将其克隆到pET28a( )中,构建得到pET-Cap质粒,利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切切下Cap基因3’末端396 bp的片段,插入到pET-LTB原核表达质粒LTB基因的3’末端,从而构建pET-LTB△Cap原核表达质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS后,用IPTG诱导重组菌,用SDS-PAGE电泳和Western blot检测诱导物。表达产物经初步纯化后用昆明系小白鼠做免疫保护实验。结果表明:pET-LTB△Cap重组融合表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白分子量约为29Ku,表达量约占菌体蛋白的36.67%,融合蛋白能被PCV-2阳性血清识别。攻毒后,所有小鼠临床表现正常。用PCR检测有1/8的免疫小鼠感染了PCV-2,而对照组8只小鼠都感染了PCV-21。PCV-2 Cap基因3’端396 bp的片段与LTB基因融合能实现高效表达,表达产物免疫的小白鼠可抵抗PCV-2的攻击此研究为PCV-2基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

猪多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素亚单位蛋白的制备及免疫原性研究

为获得针对猪萎缩性鼻炎主要病原体——多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的高免疫原性抗原,本试验构建、表达并验证该毒素的亚单位蛋白抗原,将猪多杀性巴氏杆菌毒素PMT基因与pMD19-T载体进行连接、转化,经序列分析鉴定后,分别使用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ与Blp Ⅰ限制性内切酶将其酶切为3个基因片段。将片段1（Tox1）、片段2（Tox2）和片段3（Tox3）分别亚克隆至原核表达载体pET32-b、pET32-a和pET32-b中,构建3个重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,分别进行SDS-PAGE与Western blotting检测,并使用小鼠与豚鼠初步研究其免疫原性。结果显示,构建的3个基因片段长度分别为776、409与410 bp,与GenBank中相关序列具有高度同源性;3个蛋白片段表达正常,表达量分别达到379.95、447.62与459.82 μg/mL,SDS-PAGE验证条带分别为75、77与53 ku;因3个片段位置不同,仅Tox3有Western blotting检测条带,与理论预测相符;使用3种表达蛋白免疫小鼠与豚鼠后,二免后14 d,血清经试剂盒检测阳性率达到100%,对二免后14 d小鼠攻毒保护率达到93%。本研究成功构建了PMT的3个亚单位活性片段,且具有较好的免疫原性。     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902（K88ac,ST^ ,L^ )的攻击，用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ST1的毒性，这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

霍乱毒素B亚单位基因的克隆及其核苷酸序列分析

利用 PCR技术从含有霍乱毒素 B亚单位 ( CTB)基因的质粒 p UCT1中扩增出不包括信号肽的 3 0 9bp的 CTB全基因 ,并通过点突变技术消除了 CTB阅读框内的终止密码子 ( TAA→GAA) ,以便于在 CTB基因的下游融合其他的外源基因。用限制性内切酶 Bam H 和 Eco R 对 PCR产物进行双酶切 ,以 T4DNA连接酶将其定向连接于经同样酶切处理的质粒 p ET-2 8b( )的多克隆位点上 ,构建成重组质粒 p ECTB,转化至BL2 1 ( DE3 )中。经 Bam H 和 Eco R 双酶切分析和 PCR扩增检测 ,证明重组质粒 p ECTB中含有 CTB基因。核苷酸序列分析表明 ,克隆的 CTB基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的     

Expression of Putative Escherichia coli Heat-labile Enterotoxin (LT) Receptors on Intestinal Brush Borders from Pigs of Different Ages

Many strains of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) that cause diarrhoea in young piglets secrete a heat-labile enterotoxin (LTp) that binds to specific glycoconjugates on porcine intestinal epithelial cells. Binding of LTp to an appropriate glycoconjugate facilitates the uptake and trafficking of the toxin into the cell, where it stimulates intracellular changes that promote fluid secretion and diarrhoea. The objective of the current study was to identify the LTp-binding glycoconjugates on porcine intestinal epithelial cells, the natural target cells for LTp. We found that LTp binds, in an age-correlated manner, to an acidic glycosphingolipid (GSL) that co-migrated with GM1 on thin-layer chromatography (TLC), a small acidic GSL that appears to be a sulphatide, a neutral GSL that co-migrated with neolactotetraglycosylceramide (nLc4) on TLC, and two glycoproteins (36 and 205 kDa). Of these potential LTp receptors, the GM1-co-migrating GSL was detected most intensely in young animals, while the other four LTp-binding glycoconjugates were detected most intensely in older pigs (54 weeks). Since ETEC primarily cause disease in young piglets, the GM1-co-migrating GSL is the most likely candidate for a functional LTp receptor.     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原,免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗１５ＭＬＤ的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ,ＳＴ＋,ＬＴ＋）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ＳＴ１的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌致病因子的分子生物学研究进展

阐述了新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌（ETEC）菌毛的结构、分子生物学特性、基因检测技术、菌毛抗原受体的生化特性以及菌毛载体系统的优点；另外，从分子结构与功能、作用机理、基因检测三方面叙述了新生仔猪ETEC不耐热肠毒素和耐热肠毒素的研究进展。     

Observations on production of hemolysin, heat-labile enterotoxin and antimicrobial drug resistance among enterotoxigenic Escherichia coli from pigs.

A total of 52 isolates of Escherichia coli belonging to enterotoxigenic serotypes from piglets with diarrhea were examined for hemolysis, production of cholera-like enterotoxin (LT) and susceptibility to 10 antimicrobial drugs. A strong association between production of LT and hemolysis was seen. Ninety percent of 29 hemolylic isolates were LT⁺ whereas 100% of 23 nonhemolytic isolates were LT⁻ in a commercial latex agglutination assay. Antimicrobial susceptibility tests employing disc diffusion showed that resistance to trimethoprim-sulfamethoxazole (TMS), neomycin and tetracycline was significantly less among LT⁺ isolates compared to LT⁻ ones. Enrofloxacin was the only antimicrobial drug to which all the 52 isolates were susceptible.