Patatin、Wun1启动子驱动的PPO反义基因植物表达载体的构建

以植物表达载体PC3-ASPPOty为基础,分别构建了由Patatin、Wun1启动子调控的PPO反义基因植物表达载体pCP-ASPPOty、pCW-ASPPOty,并通过直接导入法将重组质粒分别导入根癌农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定证明,此基因已整合到农杆菌Ti上。表达载体的建立为获得地上部分PPO活性正常、块茎损伤低褐化的马铃薯加工型改良品种奠定了基础。     

PRSV-CP基因小hpRNA植物表达载体的构建

将获自海南(prsv-cp hno1～4)、云南(prsv-cp yunnan)和广西(prsv-cp guanxi)的番木瓜环斑病毒株系外壳蛋白(PRSV-CP)基因序列与DQ340771、X97251(来自中国台湾的PRSV株系)以及AY162218、AY231130、DQ374153、S46722、X97251(分别来自泰国、墨两哥、巴西、美国的PRSV株系)等外壳蛋白(CP)基因序列进行比对,在CP基因高保守区设计靶向目标序列进行亚克隆,获得长度为50bp的DNA片段,并通过一步套叠PCR把50 bp 正向片段和反向片段与拟南芥内含子拼接,成功构建了小hpRNA结构的植物表达载体,为进一步培育安全性好、抗谱广的番木瓜转基因新种质奠定了基础.     

基于phy基因的双边界植物表达载体构建

采用同源克隆方法从泡盛曲霉中克隆了1 515 bp 的植酸酶基因,与黑曲霉(A. niger963)phyA2 的核苷酸同源性为95%.以植物表达载体pTTBUG8为基础,构建了由35S启动子调控、具有磷高效利用功能基因(phy)的双边界植物表达载体 pBSP.解决了bar基因及其产物 PAT蛋白的安全性及产权等问题,并为植物养分高效利用基因工程研究奠定了重要基础.     

甘蓝型油菜GPAT6基因启动子的克隆与表达载体构建

通过同源PCR克隆的方法,首次从甘蓝型油菜中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶6（sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase6,GPAT6）基因长1110bp的启动子,并将其成功构建到植物表达载体pBI121上.重组载体可用于转化拟南芥,探究甘蓝型油菜GPAT6基因的组织表达特征.     

Mineirao柱花草MSRA基因的克隆及其植物表达载体的构建

根据抗病柱花草中的1个AFLP特异片段SG2950-1设计引物,利用RACE技术从Mineirao柱花草中克隆到一个MSRA基因:经测序比对,该序列与细胞色素氧化酶系基因有较高的相似性.构建了植物表达载体,通过冻融法将该载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404,为进行该基因的功能分析奠定了基础.     

大豆F-box基因Glyma08g11030启动子克隆及植物表达载体构建

本研究以大豆Williams 82的基因组DNA为原始材料,根据前期预测的Glyma08g11030启动子序列用DNAMAN8.0设计引物,通过常规PCR方法克隆获得了Glyma08g11030基因上游长度为3 000 bp的启动子序列。在PlantCARE植物启动子区域在线预测网站上查询,预测的结果显示Glyma08g11030启动子序列里含有数量众多、功能各异的顺式作用元件。其中以TATA-box和CAAT-box这两个基本的顺式作用元件最多,此外还有许多与应答相关的顺式作用元件,如干旱、热、光、激素等。根据这些顺式作用元件在Glyma08g11030启动子序列中的位置对启动子序列进行截短并分别设计引物,采用PCR方法成功截出了3段长度分别为2 492,1 185和342bp的启动子序列,将3段序列替换pCAMBIA3301载体双酶切出的CaMV35S启动子序列,并构建了3个启动子序列驱动GUS植物融合表达载体,从而得到含不同顺式作用元件的启动子序列。研究结果将为以后分析Glyma08g11030启动子的功能和作用机理提供前期准备。     

香蕉NPR1基因的克隆及植物表达载体构建

病程相关基因非表达子(NPR1)是植物抗病信号传导的关键基因。以香蕉抗病香蕉品种为材料,根据NPR1基因序列在保守区设计引物,从香蕉cDNA中克隆获得NPR1基因片段,以RACE的方法克隆获得香蕉NPR1基因的全长,并命名为GCT119-NPR1。香蕉GCT119-NPR1基因最大阅读框(ORF)为1 707 bp。生物信息学分析结果表明,该基因含有ANK和BTB两个结构域,其中ANK结构域是NPR1基因中非常重要的结构域,在蛋白质相互作用中起着至关重要的作用。同源性分析表明,该基因与已克隆发表的NPR1基因氨基酸序列同源性为67%~82%。将其构建植物表达载体,为下一步转化工作奠定基础。     

芪合酶基因的克隆与植物表达载体的构建

为获得含白藜芦醇且具有保健作用的转基因番茄，进行了芪合酶基因克隆、植物表达载体构建及导入受体细胞的研究。从葡萄2个品种——雷司令和粉红玫瑰的叶片中提取基因组DNA，并以其为模板，经PCR扩增芪合酶基因，各获得一长约1．6Kb的片段，将这2个片段分别连接到pGEM-Teasy和pUCm-T上进行测序，1个片段长为l622bp(命名为S1)，另一个片段长为l617bp(命名为S2)。然后将Sl正向插入pEV2的果实特异性启动子TFP2和NOS终止子，构建了植物表达载体pEV2S1；将S2正向插入植物表达载体pBll2l的35S启动子和NOS终止子之间。构建了植物表达载体pBS2．将重组体pEV2S1和pBS2转化大肠杆菌E．coli XLl，并对重组体进行了筛选和鉴定．     

香蕉Maasr1基因RNAi植物表达载体的构建及鉴定

以香蕉Maasr1基因为目的基因,载体pBS为中间载体,pBBB、pBI121为表达载体,分别构建含有Maasr1基因的RNAi植物表达载体DBBB-S-I-A和含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBl121-S,并通过农杆菌介导的方式对构建的该RNAi载体沉默效果进行鉴定.结果表明:(1)利用中间载体pBS和植物表达载体pBBB成功构建了香蕉Maasr1基因的RNAi植物表达载体pBBB-S-I-A;(2)利用载体pBI121成功构建了1个含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBI121-S:(3)构建的RNAi载体pBBB-S-I-A可以抑制Maasr1基因的表达,具有较好的沉默效果.     

灰树花gpd-GF启动子的克隆与表达载体的构建

根据已经报道有强启动子活性的香菇gpd启动子设计引物,从灰树花基因组PCR扩增获得大小分别为1018,615bp的2个片段gpd-GF1和gpd-GF2,通过DNA序列测定得知二者的大小分别为1018,615bp,经NCB1中的BLASTN比较,gpd-GF1,gpd-GF2与已报道的香菇中克隆的gLeGPD基因上游序列的同源性分别为96%,98%,通过启动子预测软件分析,结果表明,gpd-GF1和gpd-GF2含有多个顺式作用元件如TATA box,GAtA box,CAAT box等,初步证实 gpd-GF1,gpd-GF2可能有较强的启动子活性。将gpd-GF1,gpd-GF2分别与切除CaMV35S启动子的pCAMB1A1301大片段进行亚克隆,构建成表达载体pCBgpdGF1和pCBgodGF2。     

额种子蛋白体靶向表达口服重组胰岛素原载体构建及转化水稻

应用水稻种子生物反应器开发口服重组胰岛素原具有重要应用前景。通过分子设计保证重组胰岛素原在人体肠道内的自主加工成熟,根据水稻密码子偏爱性人工合成了霍乱毒素β亚基和人胰岛素原的融合基因(cholera toxin B subunit fused with human proinsulin,CTBIN),并在C末端添加内质网滞留信号KDEL。通过PCR技术从粳稻品种日本晴全基因组中克隆谷蛋白启动子及其信号肽序列pGluB1sig(GluB1 promoter and its signal peptide)用于驱动融合基因CTBIN的表达,插入载体pCAMBIA1302,构建了水稻种子蛋白体靶向表达口服重组胰岛素原的载体pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-Nos。采用农杆菌介导法转化日本晴,获得了46株转基因水稻植株,Western杂交检测到CTB-人胰岛素原融合蛋白在水稻种子中表达。     

异戊烯基转移酶基因(ipt基因)的克隆、序列分析及植物表达载体的构建

从Agrobacteriumtumefaciens(strainAKE10)中分离其质粒并以质粒DNA为模板进行多聚酶链式反应,特异扩增出一条长约720bp的DNA片段,经克隆及序列测定表明,为根癌农杆菌AKE10质粒异戊烯基转移酶基因的完整编码序列,与Genebank中公布的核苷酸序列具有100%的同源性。与A.tumefaciensPO22、Tm-4、BO542菌株和A.vitisCG474、Tm4菌株质粒中异戊烯基转移酶基因进行序列比较,同源性分别为90%、89%、86%、89%和89%;推导氨基酸序列的同源性分别为90.42%、88.23%、90.10%、89.58%和89.12%。成功构建了异戊烯基转移酶基因植物表达载体pBT,为探索植物细胞分裂素生物合成的分子机制、作用机理及激素互作等研究打下了基础。      

甘薯IbNPR1基因表达载体的构建及转化烟草

为了研究甘薯NPR1基因在转基因植物广谱抗病中的应用,利用前期克隆的甘薯NPRI基因,以pCAMBIA1300质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动IbNPR1基因的植物表达载体pCAMBIAl300+IbNPRl;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化.经PCR检测,IbNPR1基因已整合到烟草基因组中.     

玉米特异启动子驱动下结核hsp65基因植物表达载体构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上;将globulin1-Hsp65联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中;电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中。结果表明：成功构建了pC1300GHsp65质粒,酶切鉴定得到3 Kb和8.6 Kb两条带,测序分析表明,克隆的Hsp65与NCBI上公布序列一致;成功转化到农杆菌中,酶切从农杆菌中所提的质粒条带大小与预期结果相符合。结果显示,已成功构建和转化了pC1300GHsp65质粒,为成功研制利用转基因植物生产抗结核口服疫苗奠定了基础。     

HARDY基因的克隆、原核表达及其植物表达载体的构建

为了给转HARDY(HRD)基因小麦研究奠定基础,利用PCR技术从拟南芥中克隆HRD基因,进行生物信息学分析,预测其编码的蛋白质结构与功能,构建原核表达载体pET28a(+)-HRD,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白的表达,同时构建pBin-HRD植物表达载体。测序分析结果表明,克隆的HRD与NCBI发布的拟南芥核苷酸序列的同源性为99%,其开放阅读框长555bp,可编码184个氨基酸,具有许多重要功能位点;成功构建了原核表达载体pET28a(+)-HRD和植物表达载体pBin-HRD,诱导表达出大小约为23.3kD的蛋白,与理论值相近。     

PSAG12序列克隆及PSAG12-ipt嵌合基因植物表达载体的构建

通过聚合酶链式反应技术，成功克隆了拟南芥SAG12基因5′端2130bp的非编码序列PSAG12。结构分析结果表明，该序列由55bp的5′－UTR和－1－－2075的5′端非转录序列构成，－1－－1345为拟贰芥SAG12基因启动子功能区，具有－1181－－1345增强子序列和衰老特异表达关键序列－571－－603，但无典型的TATA box、CATT box和转录起始位点帽子结构序列，成功构建了PSAG12－ipt嵌合基因植物表达载体pAGT，为通过基因转移技术人为控制植物叶片细胞分裂素含量，延迟叶片衰老打下了基础。     

水稻OsWRKY89基因启动子的表达特性

利用PCR技术从粳稻品种秀水11中扩增了转录因子WRKY89编码区5′上游大小为1470 bp的调控序列,命名为OsW89p,将它与GUS基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法将载体转化水稻,GUS组织化学分析结果表明,OsW89p驱动的GUS基因在转基因植株各个时期的叶、茎和叶鞘中均有表达;在花器的外稃和花药中有活性而在花粉和成熟种子中均无活性;种子萌发时在胚中有活性;2.5叶期时在种子根、不定根和侧根中均有活性但根尖中无活性,5叶期时根部只有侧根中有活性。分析了GUS在T1代苗期时的诱导表达特性,GUS荧光测定结果表明：1) GUS的表达被茉莉酸甲酯增强,诱导倍数是4.0,被2,4 D抑制,水杨酸对OsW89p的表达几乎没有影响;2) 用NaCl和PEG这2种非生物因子处理转基因苗根部,根中GUS的表达被抑制,但叶片中可被诱导增强;3) GUS的表达可被紫外线照射、高温(42℃)、低温(5℃)和伤处理这4种非生物逆境因子增强,其中以紫外线照射处理的诱导倍数最高。