烟草电压依赖阴离子通道NtVDAC1.1的电子克隆及生物信息学分析

为研究电压依赖阴离子通道(VDAC)基因在烟草根系分泌有机酸的作用,进而为了解该基因的功能和应用提供基础,以拟南芥At VDAC1(NM_110994)为搜索序列,应用电子克隆技术得到一条烟草VDAC基因全长c DNA,命名为Nt VDAC1.1。生物信息学分析表明该基因全长为1 018 bp,有着完整的开放阅读框,编码276个氨基酸。进化关系及同源性分析表明,Nt VDAC1.1与其他物种的VDAC有着较高的相似性,其中与茄科植物马铃薯三个膜孔蛋白有着很高的一致性(0.768~0.902)。功能分析显示,Nt VDAC1.1为膜孔蛋白,参与了阴离子的转运、阴离子转运调节和跨膜运输。二级和四级结构分析均表明,Nt VDAC1.1含有α-螺旋和β-折叠。氨基酸位点分析表明,该蛋白具有多种类型的修饰位点,其中的磷酸化位点说明该基因与信号转导有关,对阴离子通道活性具有调节作用。     

烟草Nt-GAD的氨基酸序列分析

为从分子层面研究烟草Nt-GAD的氨基酸序列,采用Protparam、Interpro、Blast、Muscle、Phyml和Treedyn工具,分析烟草Nt-GAD氨基酸序列的理化特性、结构域和进化树。结果表明：烟草Nt-GAD成员的等电点均处于5.5～6之间,且Nt-GAD1和Nt-GAD2同源性最高,此外Nt-GAD2的耐热性最好,Nt-GAD3的稳定性最强;烟草Nt-GAD属于磷酸吡哆醛依赖性脱羧酶家族和谷氨酸脱羧酶家族,且具有磷酸吡哆醛依赖性转移酶同源超家族结构域,C末端存在独特区域钙调蛋白结构域,通过进化树分析烟草Nt-GAD成员被划分为三组,其中烟草Nt-GAD3(第一组)分化较为突出,而Nt-GAD2(第三组)则较为保守,而Nt-GAD1和Nt-GAD4被划分为第二组。     

烟草新型胱硫醚-γ-合成酶的检测与分析

利用少量细胞分离技术和RT-PCR技术,在烟草合子中克隆到一种新型胱硫醚-γ-合成酶基因,命名为Nt CGS-4。序列分析显示新基因开放性阅读框长度为1 611 bp,编码537个氨基酸,预测分子质量为57.931 2 ku,等电点为6.15。利用染色体步移技术获得该基因5′上游2 696 bp的侧翼序列(启动子和5′UTR)。系统进化分析表明,该基因与多种农作物的胱硫醚-γ-合成酶基因具有较高同源性。烟草新型胱硫醚-γ-合成酶Nt CGS-4可能在烟草早期胚胎发生中参与甲硫氨酸的生物合成和代谢。     

烟草蛋白酶体α2型亚单位的克隆和序列分析

为研究烟草识别病毒并将其降解为蛋白酶体基因,以拟南芥的蛋白酶体α2型亚单位基因全长c DNA序列(Gen Bank登录号:AF043520.1)为信息探针,用电子克隆的方法从烟草栽培品种中克隆到1个蛋白酶体基因Nt PAB1,并对其进行序列分析。结果表明,Nt PAB1包含完整的开放读码框,编码219个氨基酸,含有1个保守域proteasome_alpha_type_2;通过同源比对和进化分析发现,Nt PAB1氨基酸序列与葡萄PAB1的序列一致性达到98%。以上结果表明,Nt PAB1是栽培烟草中未报道的编码蛋白酶体基因。     

烟草COMT氨基酸序列的生物信息学分析

为了研究烟草COMT氨基酸序列,通过PROTPARAM、TargetP 1.1 Server和MEME工具获取烟草COMT成员的生理特性、亚细胞定位和保守基序的相关信息。结果表明:Nt COMT1、Nt COMT2和Nt COMT3序列中氨基酸含量所占比重位于前三的均含有亮氨酸,且烟草COMT成员属于稳定性高、耐热性强的酸性蛋白;NtCOMT1和NtCOMT2的信号肽较弱,定位于细胞质中,而NtCOMT3的信号肽相对较强,定位于叶绿体中;烟草COMT成员均被检测出6个保守基序,且保守基序的类型和排列顺序均保持一致。     

美国红鱼和大黄鱼β-珠蛋白基因的克隆和遗传进化分析

根据已发表的其他脊椎动物β-珠蛋白基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法首次克隆到美国红鱼和大黄鱼β-珠蛋白cDNA,其开放读码框均由447个碱基组成,编码148个氨基酸的多肽,预测的相对分子量分别为16 333和16 148 Da,两者核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性分别为90.4%与81.2%.将推导的美国红鱼和大黄鱼β-珠蛋白氨基酸序列与其他鱼类及人β-珠蛋白氨基酸序列进行同源性比较,其同源性在35.5%～70.3%,它们与同属真口鱼纲的真鲷、黄尾鲱鱼、鲤鱼、虹鳟等的同源性较高,而与肉鳍鱼纲的肺鱼及板鳃纲的鲨鱼的同源性较低;二级结构预测表明,美国红鱼和大黄鱼β-珠蛋白存在类似哺乳动物的8个α-螺旋区,在近端与远端与血红素结合的组氨酸高度保守.     

烟草(云烟87)NBS-LRR类同源抗病基因克隆及分析

[目的]克隆并分析烟草NBS-LRR类抗病基因的同源序列(RGAs),为采用同源克隆技术挖掘烟草抗病基因提供理论参考.[方法]从基于NBS-LRR类抗病基因保守序列设计的简并引物中筛选扩增效果较好的引物用于扩增烟草RGAs,采用DNAMAN 6.0翻译成氨基酸序列,并与已知的其他植物抗病基因进行聚类分析.[结果]克隆获得6条与参比抗病基因具有高度同源性的烟草RGAs,大小在500 bp左右,但仅有4条RGAs具有连续的开放阅读框(ORF)及编码NBS功能结构域的核苷酸序列,命名为TRGA-87-1~TRGA-87-4.这4个烟草RGAs编码的氨基酸序列均含有NBS类抗病蛋白的多个典型保守基序,与已知的多种植物抗病基因编码的氨基酸序列均具有较高的相似性,其中,与烟草相关抗病基因编码的氨基酸序列相似性最高,为97.00%~100.00%,与其他植物的抗病基因编码氨基酸序列相似性为29.00%~53.00%,这些序列可分为3个亚类,其中TRGA-87-2与烟草N和亚麻L6聚为一类(TRGAⅠ),属于TIR-NBS-LRR类;TRGA-87-3和TRGA-87-4与水稻Xa-1和番茄Mi聚为一类(TRGAⅡ),属于non-TIR-NBS-LRR类,TRGA-87-1与拟南芥RPM1聚成一类(TRGAⅢ),属于non-TIR-NBS-LRR类.[结论]同源扩增技术可用于烟草中抗病基因的克隆、功能分析及定位等研究.     

烟草PPO氨基酸序列分析

为研究烟草PPO的理化特性,采用PROTPARAM、SMART和NPSA-PRABI工具解析烟草PPO成员的生理特性、结构域和二级结构。结果表明:烟草PPO为酸性氨基酸,NtPPO1、NtPPO2和NtPPO3属于不稳定的蛋白,其中以NtPPO1的耐热性相对较强,三者共同含量较高的氨基酸为亮氨酸和脯氨酸;NtPPO1、NtPPO2和NtPPO3均含有Tyrosinase、PPO1_DWL和PPO1_KFDV结构域,且NtPPO1和NtPPO2含有信号肽;烟草PPO成员的二级结构主要为无规则卷曲,其次是α-螺旋,各二级结构排列较为分散。     

大豆与棉花基因组中抗病基因类似物的相似性分析

已知许多植物抗病基因的蛋白质产物具有保守的结构域,如NBS、ILRR、TM等。根据烟草的N基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS2基因的保守序列设计了1对简并引物,以应县小黑豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得16个不同的RGA片段,大小为470～545bp,且不同程度地含有抗病基因的保守序列,如GGVGKTT、GSRII、GIPL等。与已知大豆、棉花RGA进行比较,发现获得的大豆。RGA和用相同引物扩增获得的棉花RGA核酸序列以及相应的氨基酸序列之间同源性较低,与已经克隆的大豆RGA及其氨基酸序列之间有较高的相似性。     

绵羊TGFβ2基因及其剪切体的克隆与生物信息学分析

旨在克隆绵羊TGFβ2(Transforming growth factor-β2)基因CDS,解析其序列及编码蛋白的生物学特性,为绵羊生产利用提供理论基础。采用PCR技术克隆获得TGFβ2基因的CDS,并进行生物信息学分析。结果表明:绵羊TGFβ2基因的CDS长度为1 329bp,编码442个氨基酸;其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2由于CDS部分缺失分别编码331和414个氨基酸。绵羊TGFβ2及其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2编码蛋白的理论等电点分别为8.74、7.60和8.82,均存在1个信号肽和1个跨膜结构域,由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲构成;序列同源性分析发现,绵羊TGFβ2基因编码区的核苷酸和氨基酸序列与其他哺乳动物同源性较高,进化树分析表明,绵羊TGFβ2氨基酸序列与人类的进化关系较近,与斑马鱼较远;细胞定位分析表明TGFβ2及其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2主要在细胞外基质中发挥作用,调控下游靶基因的表达。获得绵羊TGFβ2及其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2完整的CDS,与TGFβ2转录本相比,TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2分别缺失111和28个氨基酸序列,其可能通过与TGFβ2转录本不同的分子调控机制发挥重要的生物学作用。     

烟草半胱氨酸蛋白酶的基因和蛋白序列分析

以ABW71226.1、BAA96501.1、ACB70409.1、AAW78660.1和ADV41672.1为材料,采用生物数据分析工具对烟草的半胱氨酸蛋白酶的基因和蛋白序列进行分析,分别以GSDS、MEME和Signal P 4.1工具对其基因结构、保守基序和信号肽进行检测。结果显示,Nt CP-1和Nt CP-2基因具有7个外显子,Nt CP-3和Nt CP-4基因含有4个外显子,Nt CP-5基因具有3个外显子,Nt CP-1、Nt CP-2和Nt CP-5基因具有上游序列,Nt CP-1、Nt CP-2、Nt CP-4和Nt CP-5基因具有下游序列;检测Nt CP共有5个Motif,其核心保守基序区为Motif-1—Motif-2—Motif-4,且位于木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶结构域中,Motif-1和Motif-2含有半胱氨酸和谷氨酰胺;Nt CP均属于信号肽,Nt CP-1和Nt CP-2的信号区分布相同(1~22),Nt CP-3和Nt CP-4的信号区分布相同(1~20),Nt CP-5的信号区为1~29。     

弓形虫MIC3蛋白质的二级结构及B细胞抗原表位预测

目的：预测弓形虫MIC3的二级结构和B细胞抗原表位。方法：采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,经酶切及DNA测序鉴定,推导出相应的氨基酸序列,并与GenBank上已知氨基酸序列（登录号CAB56644）进行比对。然后采用Garnier-Robson方法、Chou-Fas-man方法和Karplus-Schulz方法预测蛋白质的二级结构;按Hopp-Woods方案、Emini方案及Jameson-Wolf方案分别预测蛋白质的亲水性、表面可能性以及抗原性指数,并综合分析预测MIC3的B细胞抗原表位。结果：根据扩增基因推导MIC3的氨基酸序列与GenBank上相应氨基酸序列的同源性达99·7%,预测其结构中含有较多的α-螺旋、少量的β-折叠、非常丰富的β-转角和一定的不规则卷曲区段,在MIC3的N端第83~94、第136~141区段和第240~243区段内或其附近最有可能是B细胞抗原表位的优势区域。结论：预测MIC3的二级结构和B细胞表位,为人工合成优势肽段进行弓形虫病的疫苗研究提供依据。     

烟草NtPLR1基因克隆与表达分析

维生素B_6(VB_6)在植物体内参与多种生化反应,对植物生长至关重要,吡哆醛还原酶(PLR)是VB_6代谢转换的作用酶,催化吡哆醛(PL)生成吡哆醇(PN),对维持细胞内VB_6的动态平衡发挥重要作用,而PLR在植物中鲜有报道。以拟南芥Arabidopsis thaliana吡哆醛还原酶氨基酸序列At PLR1为模板,在公用数据库通过同源比对获得数条烟草Nicotiana tabacum Nt PLR1基因的片段,结合互补脱氧核糖核酸(c DNA)的末端快速扩增-聚合酶链式反应(RACE-PCR)技术获得了烟草吡哆醛还原酶Nt PLR1基因。该基因全长1 370 bp,编码369个氨基酸残基,预测其编码蛋白的分子量为41 kDa,理论等电点为9.42。氨基酸多序列比对结果表明:Nt PLR1与其他物种的PLR1相似性较高。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析结果表明:外源吡哆醛PL处理时,Nt PLR1表达先升高后降低,在4 d达到顶峰。相应地,高效液相色谱分析结果表明:烟草叶片中PL含量随时间逐渐降低而吡哆醇PN含量逐渐升高,表明Nt PLR1可像酵母PLR一样,催化PL形成PN。此外,定量分析结果表明:Nt PLR1在烟草根、茎和叶片中均有表达,其中在叶片中表达显著高于其他部位(P0.05)。在紫外线、氧化和盐害胁迫下,Nt PLR1的表达与对照相比均显著上调(P0.05),表明Nt PLR1对这3种逆境有响应,可能参与烟草的抗逆过程。将Nt PLR1连入原核表达载体p ET32a,并进行诱导表达,成功表达出目的蛋白。报道的烟草Nt PLR1基因功能为进一步探明植物PLR基因的功能和调控机制以及VB_6的生物合成提供了重要参考。     

不同镉积累基因型烟草CAX2基因克隆及序列分析

【目的】克隆不同镉积累基因型烟草中阳离子转运基因（CAX2）,为研究烟草CAX2基因在镉转运过程中的作用机理提供参考。【方法】根据NCBI中马铃薯的CAX2序列,BLAST烟草EST数据库,设计引物克隆普通烟草（Nicotiana tabacum）K326和黄花烟草（N. rustica）的CAX2基因,使用生物信息学方法进行序列分析。【结果】K326和黄花烟草CAX2基因（分别命名为NtCAX2和NrCAX2）编码区长度均为1314 bp,核苷酸序列一致性达98.0%;二者均编码437个氨基酸,仅有5个氨基酸位点存在差异。NtCAX2和NrCAX2蛋白同源性为98.9%,均有两个完全相同的Na+-Ca2+交换蛋白结构域,分别位于CAX2102~249 aa和293~426 aa区域,具有CAX家族共有的结构特征。NtCAX2和NrCAX2理论等电点分别为5.54和5.45,均有较强疏水性,包含11个跨膜结构域和两个重复区域α-1、α-2,三级结构以α-螺旋为主。系统进化分析结果表明,NtCAX2和NrCAX2与马铃薯（StCAX2）的亲缘关系最近,蛋白同源性均高于92.0%。【结论】K326和黄花烟草CAX2基因同源性较高,CAX2基因在茄科具有较高保守性。     

烟草NtCIPK2基因的克隆及表达分析

CIPK(CBL-interacting protein kinase)是一类具有生物活性的丝/苏氨酸蛋白激酶,通过与类钙调神经素B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)相互作用从而调节植物在适应或抵制非生物逆境胁迫中的生理活动。基于同源序列克隆烟草K326中Nt CIPK2基因c DNA全长,采用q RT-PCR分析Nt CIPK2的组织及逆境胁迫下特异性表达。结果表明,该基因全长1 341 bp,编码446个氨基酸残基,预测分子量为50.3 ku,等电点为8.90。同源性分析结果显示,该蛋白与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)CIPK2有95%的同源性,故命名为Nt CIPK2。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水蛋白,其N端含有活化环结构域S_TKc,C端含有调节结构域CIPK-C,可能定位在质膜。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中茎中表达量最高。逆境胁迫试验表明,该基因受低钾、高盐、干旱、H2O2和ABA诱导,参与烟草非生物逆境胁迫的响应。     

大豆与棉花抗性基因类似物的同源性比较及其进化分析

已知许多植物抗病基因的蛋白质产物具有保守的结构域 ,如NBS、LRR、TM等。根据烟草的N基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS 2基因的保守序列设计了 1对简并引物 ,并以应县小黑豆基因组DNA为模板 ,PCR扩增获得 16个不同的RGA片段 ,大小在 470～5 45bp ,且不同程度地含有抗病基因的保守序列 ,如GGVGKTT、GSRII、GLPL等。与已知大豆、棉花RGA进行比较 ,发现该试验获得的大豆RGA和用相同引物扩增获得的棉花RGA核酸序列以及相应的氨基酸序列之间同源性较低 ,与已经克隆的大豆RGA及其氨基酸序列之间相似性较高。在分子水平揭示了大豆及棉花RGA的起源及其进化。     

锯缘青蟹精氨酸激酶基因的克隆与表达

通过分子生物学方法,克隆得到锯缘青蟹（Scylla serrata）精氨酸激酶（Arginine Kinase,AK）开放阅读框基因序列.测序结果显示：该开放阅读框基因的序列长度为1 071 bp,编码356个氨基酸残基;该序列登录Genbank（GQ：851626）,序列比对结果显示,锯缘青蟹精氨酸激酶与凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）精氨酸激酶的氨基酸序列同源性高达94%,与岸蟹（Carcinus maenas）、中华绒鳌蟹（Eriocheir sinensis）等甲壳类动物的精氨酸激酶也有较高的同源性,均高于90%;将克隆得到的锯缘青蟹精氨酸激酶基因与pGEX-4T-3载体连接,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导得到分子质量为65 ku的融合表达蛋白（GST-AK）,经兔抗锯缘青蟹精氨酸激酶多克隆抗体的免疫印迹分析证实,GST-AK具有抗原性.     

小卷蛾斯氏线虫β-微管蛋白基因的克隆与序列分析

用TRIZOL法提取了小卷蛾斯氏线虫RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE)技术克隆了两条小卷蛾斯氏线虫β-微管蛋白基因cDNA的3′端序列。将得到的cDNA序列提交到GenBank,分别获取登录号EU049857和EU049858。两个序列长度分别为1372碱基(SCTUB1)和1374碱基(SCTUB2),分别编码434和432个氨基酸,编码的蛋白的分子量在48kDa左右。氨基酸的124~131位存在一个微管蛋白信号片段GGGTGSG。序列分析表明,分离得到的两个基因与其他线虫的微管蛋白基因具有较高的同源性,核苷酸序列同源性在65%以上,氨基酸序列同源性在81%以上,两个氨基酸序列都含有两个氨基酸保守区NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTE。     

木豆Actin基因片段的克隆及序列分析

根据大豆Actin基因的保守序列设计一对引物Primer 1和Pri mer 2,以木豆叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PMD-18T载体。阳性克隆经PCR检测后测序,序列分析结果表明,该片段长302bp,编码100个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在89%以上,其中与大豆的同源性达94%;与氨基酸序列的同源性均在90%以上。     

亚洲玉米螟幼虫P450基因片断的克隆与序列分析

根据G enB ank中昆虫P 450氨基酸保守序列设计了1对简并引物,以亚洲玉米螟田间自然种群基因组DNA为模板,扩增得到一条长度为603 bp的特异性DNA片段,编码201个氨基酸。将此氨基酸序列与G en-B ank中已知序列采用B last及C lusta lW EB I软件进行同源性分析,结果表明该氨基酸序列与CYP 4家族的同源性较高,达37%~53%,初步推测此序列为CYP 4家族的一员。