新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为了解新型鸭呼肠孤病毒(NDRV TH11株)σC蛋白的抗原性,采用RT-PCR方法扩增了NDRV TH11株σC蛋白的编码基因,将其克隆于原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-σC重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析表明该重组蛋白获得高效表达,并具有较好的反应原性。以纯化的σC蛋白免疫实验兔制备了抗σC蛋白的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示其效价达1∶20 000以上;间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别NDRV的σC蛋白,显示出σC蛋白具有良好的免疫原性。     

新型鸭呼肠孤病毒分离株的致病性研究

【目的】研究新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的致病性。【方法】以NDRV分离株NP01、NP03、NPM为供试病毒,分析其对禽胚(番鸭胚、鸡胚)、部分禽类(雏番鸭、雏半番鸭、雏鸡、雏鹅)及细胞的致病性。【结果】NDRV分离株经尿囊腔接种能100%致死12日龄番鸭胚和9日龄鸡胚。2日龄雏番鸭、雏半番鸭经腿肌、口鼻、爪垫等途径人工感染NDRV分离株后,出现了与自然病例相同的病症,NDRV分离株对雏番鸭和雏半番鸭的致死率分别为20%~53%和13%~33%,同时能从病死鸭肝脾中回收到该病毒,耐过鸭大多成为僵鸭;15日龄雏鸡和2日龄雏鹅人工感染NDRV分离株后观察20 d,均未表现出NDRV致病的临床症状。NDRV分离株具有较广的细胞亲嗜性,能在MDEF、CEF、AD293、Marc145、Vero、ST、MDCK等细胞中增殖并产生细胞病变,病变细胞呈现巨融合状;但NDRV分离株在PK细胞中盲传3代均未出现病变。【结论】NDRV在致病特性方面明显不同于禽呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒。     

新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒和鸭坦布苏病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

[目的]建立能同时检测新型鸭呼肠孤病毒(New-type duck reovirus,NDRV)、新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)和鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)的方法.[方法]根据NDRV、NGPV和DTMUV基因组的保守区域设计3对特异性引物...     

鸭呼肠孤病毒疫病的防治与展望

这些年,随着鸭呼肠孤病毒感染宿主的不断扩大,此病毒感染已成为危害养鸭业最为严重的传染性疾病之一。在相关报道中发现,此病感染鸭的品种同样有增多趋势,国外学者Clork等提出病毒致病性的3大类型。I型,造成禽类暂时性消化系统紊乱,诱发吸收障碍。II型,以病毒性关节炎综合征为典型。Ⅲ型,可诱发前两者。笔者认为这样的划分较为权威。文章由此而展开论述,分析鸭呼肠孤病毒的病原学特点,就国内鸭呼肠孤病毒感染做系统概述。同时,进一步分享此病的防治经验,并对鸭呼肠孤病毒感染症状呈多样性的思考;对鸭呼肠孤病毒感染防治难度大等相关问题分析与展望,总结要点知识以供参考和借鉴。     

两株不同疾病型鸭呼肠孤病毒部分生物学特性的比较

通过电镜观察、血清交叉中和试验、病毒的细胞病变特征、病毒基因组特征及S3蛋白基因分析等方法,比较2株不同疾病型鸭源呼肠孤病毒的生物学及基因组特性差异.染毒细胞的超薄切片观察结果表明,2种病毒为球形,直径约70 nm,新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)在胞浆中呈晶格状分布,而番鸭呼肠孤病毒(MDRV)呈零星、散在分布;MDRV和NDRV之间的相关系数R值很小,抗原相关性较低;NDRV的细胞病变类型以巨融合为主,而MDRV则以细胞圆缩、坏死为主;经尿囊腔接种,NDRV能致死鸡胚,而MDRV不能致死鸡胚.MDRV及NDRV的S基因片段的迁移率明显不同;两者S3基因处在不同的进化分支.结果初步表明不同疾病型的水禽呼肠孤病毒MDRV和NDRV的生物学特性有较大差异.     

新型鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗的制备及免疫原性分析

鸭出血性坏死性肝炎是新型鸭呼肠孤病毒引起的危害养鸭业的一种新传染病。为防制该病,本研究以NDRV JM85株为种毒研制成油佐剂灭活苗,并通过免疫血清学检测及攻毒保护试验评价疫苗效果。结果表明,该疫苗安全性好,免疫原性强,麻鸭二免后28d产生较高的中和抗体,并能维持较长时间。种番鸭免疫后的子代雏番鸭具有一定的母源抗体,能够抵抗强毒的感染,可用于防制鸭新型呼肠孤病毒病。     

鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体的研制

用DVH弱毒疫苗和DVH油乳剂苗免疫健康高产蛋鸡制备高免卵黄抗体,研究了高免卵黄抗体治疗雏鸭DVH的疗效。结果表明,高免卵黄抗体治疗DVH的疗效取决于卵黄抗体的中和效价、治疗时间和免疫途径。卵黄抗体的中和效价应达28.5以上,并且在感染DVH 24 h以内对雏鸭进行肌肉注射,免疫效果最好。     

番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗在番鸭体内中和抗体消长规律的研究

为明确番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗在番鸭体内中和抗体消长规律,采用固定病毒稀释血清法,测定了经弱毒疫苗免疫后的雏番鸭不同时间其血清中和抗体效价。结果显示：疫苗注射1日龄雏番鸭,免疫后28 d部分鸭血清中出现抗体,35 d全部鸭血清中出现抗体;6个月抗体效价达高峰,有效免疫期在18个月以上。表明番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗诱导的中和抗体产生期较晚,但持续期长。     

新型鸭呼肠孤病毒弱毒S株在雏番鸭体内的增殖规律

【目的】研究新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）弱毒S株C30在雏番鸭血液中的病毒血症,口咽、泄殖腔的排毒规律及靶器官的带毒时间,了解弱毒S株在雏番鸭体内的增殖规律和致弱机理。【方法】设计特异性引物,建立检测NDRV核酸的RT-qPCR方法;新型鸭呼肠孤病毒弱毒S株第30代（NDRV-S-C30）腿部肌肉注射2日龄雏番鸭,在免疫后1、2、3、4、6、8、10、12、14 d(Days post vaccination,dpv)采集其血液、肝脏、脾脏、泄殖腔分泌液和口咽液,用RT-qPCR方法检测NDRV在血液、口咽、泄殖腔及靶器官的增殖能力及带毒时间。【结果】建立了检测NDRV核酸的特异性RT-qPCR方法,使用该方法检测NDRV弱毒攻毒雏鸭的口咽和泄殖腔排毒时间分别为2～8 d和2～10 d,排毒高峰期为4～6 d;病毒血症时间为1～4 d,其中1～2 d为病毒血症高峰期;弱毒在肝脏的带毒时间为3～6 d,在脾脏的带毒时间为1～8 d。【结论】NDRV-S-C30弱毒株免疫雏番鸭后可通过口腔和泄殖腔向外界排毒,仅能引起较弱的病毒血症反应,且在肝脏中的增...     

新型鸭呼肠孤病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL^-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。     

抗番鸭细小病毒卵黄抗体的制备

[目的]有效预防和治疗番鸭细小病毒病。[方法]用番鸭细小病毒连续免疫产蛋母鸡3次,收集鸡蛋,并制备出高免卵黄抗体。通过琼脂扩散试验对制备的卵黄抗体进行效价测定,用雏番鸭进行中和与治疗试验。[结果]制备的卵黄抗体琼扩效价达到1∶32,能有效中和番鸭细小病毒对雏番鸭的致病性,对发病的雏番鸭有很好的治疗作用。[结论]该研究为番鸭细小病毒的预防和治疗提供了一种有效的生物制品。     

番鸭呼肠孤病毒感染对体液免疫功能的影响

 【目的】探讨番鸭呼肠孤病毒感染对体液免疫功能的影响。【方法】将60只5日龄健康番鸭,随机平均分为两组,分室隔离饲养。试验组雏鸭每只腿部肌肉注射番鸭呼肠孤病毒细胞毒0.2 mL（0.01个TCID50=10-3.7558）,对照组相同部位注射等量灭菌生理盐水,每隔5 d,应用组织化学法检测脾脏和法式囊中浆细胞数量,间接血凝法检测血清中禽流感抗体水平和放射免疫法检测血清中IL-2,IL-6含量的变化。【结果】番鸭感染呼肠孤病毒,法氏囊和脾脏中浆细胞数量试验组均比对照组少,在感染后15 d达到最少,试验组极显著地低于对照组（P＜0.01）;同时,番鸭感染呼肠孤病毒可抑制禽流感抗体形成,感染后15d抗体水平最低,试验组极显著地低于对照组（P＜0.01）,此后又逐渐升高;血清中IL-2和IL-6的含量也在感染初期降低后又逐渐回升,感染后10 d均达最低,试验组极显著地低于对照组（P＜0.01）。【结论】番鸭呼肠孤病毒感染5日龄雏番鸭,通过破坏免疫器官(法氏囊,脾脏)中的浆细胞,降低了机体抗体形成能力,同时,也通过对免疫分子的影响反过来影响机体的体液免疫功能。提示,增强机体体液免疫功能是防制该病的一个途径。     

番鸭呼肠孤病毒分子流行病学研究

选取1998～2009年福建省不同地区番鸭中分离到番鸭呼肠孤病毒分离株中具有代表性的10株,用RT-PCR技术扩增其S1和S4基因的功能区片段,进行序列测定.序列分析表明所扩增的S1基因的目的片段为819bp,S4基因目的片段为992 bp.参照国内外已发表的部分毒株S1和S4基因序列,构建番鸭呼肠孤病毒的遗传进化树,分析遗传进化关系.国内各分离株S1基因同源性为92.2％～96.7％,与国外89026株同源性为88.5％～92.8％,与禽呼肠孤病毒S1133株同源性为76％～78％.国内各分离株S4基因同源性为95.2％～99.3％,与国外89026株同源性为92.3％～94.5％,与禽呼肠孤病毒S1133株同源性为21.2％～21.5％.通过遗传进化树可以看到MDRV与同属的ARV序列形成了2个大分支,而MDRV序列分为2个小分支:一支为10株分离株和国内分离株,说明国内分离株没有明显差异;一支为国外分离株89026株,这说明国内分离株与国外毒株存在地域差异.     

应用半套式RT-PCR技术诊断番鸭呼肠孤病毒病

参考GenBank中番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计并合成3条引物C1、HP11和HP12,组成半套式RT-PCR,扩增片段为300 bp.应用该半套式RT-PCR对MDRV、禽呼肠孤病毒(ARV)、番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸡胚成纤维细胞(CEF)和番鸭胚成纤维细胞(MDEF)培养物进行扩增.结果仅能从MDRV中扩增出300 bp特异片段,而不能从ARV、MPV、GPV、CEF和MDEF细胞培养物中扩增出特异片段;该方法检测灵敏度为1 fg核酸,重复性好.对人工感染和临床疑似病例用病毒分离和半套式RT-PCR进行检测,2种方法符合率为100%.因此,该半套式RT-PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒病的临床快速检测.     

番鸭呼肠孤病毒在番鸭体内的动态分布和排毒规律

应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒在人工感染番鸭体内的动态分布和排毒规律.结果显示在感染后ld可在肝、脾脏、法氏囊、胸腺和盲肠扁桃体中检出病毒RNA,表明病毒首先入侵免疫器官;随后其他器官中逐渐检测到病毒.高峰期为攻毒后7～14 d,所有器官中均能检测到病毒,此时也是病毒感染发病最严重的时间.感染后14 d,在肺和...     

鸭呼肠孤病毒人工感染SPF鸡胚的病理学研究

【目的】前人研究表明禽呼肠孤病毒可以经卵垂直传播, 禽呼肠孤病毒能引起雏禽的病毒性关节炎、呼吸道和肠道疾病、肝炎、心肌炎、免疫抑制等。以实验室分离的鸭呼肠孤病毒HP080421株为研究对象,该毒株引起病变主要以鸭软脚为主要临床特征,病鸭肝脏和脾脏表面有大量的白色坏死灶、肾脏肿大、出血为主要病变特点。研究了鸭呼肠孤病毒对鸡胚的致病性,通过雏鸡的病理变化特点,探讨所分离的HP080421鸭呼肠孤病毒株是否也可感染鸡群,旨在为鸡场鸭呼肠孤病毒感染的防控提供理论依据。【方法】运用华中农业大学兽医病理学实验室分离鉴定的HP080421株鸭呼肠孤病毒通过尿囊腔接种SPF鸡胚,建立SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型,培养鸡胚至雏鸡出壳,运用临床观察、病理剖检、H.E染色和免疫组织化学染色等病理组织学检查方法,对鸭呼肠孤病毒感染SPF鸡胚进行病理学研究和致病性分析。【结果】研究发现病毒感染鸡胚孵化培养至22-23日龄均啄壳,但不能自主出壳,需人工剥壳。病理剖检可见雏鸡的肝脏、脾脏肿胀质脆,表面及实质分布有黄白色坏死灶;脑部组织肿胀,并可见出血点和出血斑。H.E染色的组织病理学观察可见接毒组雏鸡肝脏、脾脏的坏死灶周围有大量淋巴细胞浸润;法氏囊的滤泡髓质部和胸腺的髓质部淋巴细胞减少、缺失;脑、肺脏、肾脏存在不同程度的淤血、出血和水肿;免疫组织化学染色结果表明：病毒阳性信号主要分布于肝脏、脾脏、肺脏和法氏囊等器官,并且位于上皮细胞和巨噬细胞的细胞质和胞核内。【结论】鸭呼肠孤病毒株HP080421 能够在SPF鸡胚中复制增殖,并使雏鸡主要器官发生明显的病理变化,病理变化主要集中在肝脏和淋巴器官,因此鸭呼肠孤病毒可通过垂直传播感染鸡群,还可导致雏鸡免疫抑制。本研究通过SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型,阐述了鸭呼肠孤病毒感染鸡群的可能性,因此在实际养殖过程中,养殖户要防止鸭呼肠孤病毒对鸡胚的污染,切断传播途径,以达到预防鸡群感染鸭呼肠孤病毒的目的。     

心包积液-肝坏死综合征高免卵黄抗体的研制

采取心包积液-肝坏死综合征病鸡的肝脏匀浆冻融,接种SPF鸡胚,制备尿囊液灭活水苗,用两种免疫程序对产蛋鸡进行免疫,用琼脂扩散试验检测其卵黄抗体水平,制备高免卵黄抗体。经中和试验和临床试验,结果显示高免卵黄抗体对该病的预防和治疗效果明显。     

卵黄抗体测定与鸡新城疫免疫接种的应用研究

利用血凝（ＨＡ）和血凝抑制（ＨＩ）试验，对来自同一机体和同一鸡群非同一机体的２７９６只罗曼蛋鸡血样及蛋样进行了鸡新城疫血清和卵黄抗体水平的检测。结果表明：血清和卵黄无论来自同一机体，还是来自同一鸡群，所测抗体效价基本一致。对６１０枚入孵种蛋不同时间卵黄抗体和该批种蛋孵出的６１０只雏鸡不同日龄血清抗体水平进行了检测，发现种蛋卵黄抗体效价与雏鸡血清抗体效价有一定的相关性，用卵黄监测种蛋的抗体水平可以得知雏鸡出壳后首免时间。     

新型鸭肝炎病毒感染雏鸭组织内病毒抗原的分布

应用免疫组织化学方法,对人工感染新型鸭肝炎病毒雏鸭体内的病毒分布进行了动态观察。结果表明:接种后不同时间,在肝脏、脾脏、胰脏、胸腺和法氏囊组织中均可检测到新型鸭肝炎病毒抗原,而肾脏、心脏、脑组织中均未检测到病毒抗原。病毒抗原均位于阳性细胞的细胞质中。研究结果提示,感染雏鸭的肝脏和胰脏的组织病理变化与病毒的分布有关。