实时荧光定量PCR技术研究进展及应用

实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术.它利用荧光实时检测PCR反应,具有灵敏度高、特异性强、节约时间等优点.文章就常用的4种方法,即DNA结合染色、水解探针、分子信标和杂交探针的原理和特点进行介绍,同时综述了荧光定量PCR技术在实践中的应用.     

实时荧光定量PCR技术在水产研究中的应用

实时荧光定量PCR（Real—time fluorescent quantitative PCR,FQ—PCR）技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种通过检测荧光信号的变化进行核酸定量的技术。与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。本文综述了实时荧光定量PCR技术的基本原理及其在水产研究中的应用。     

实时荧光定量PCR技术及其在蜜蜂疾病诊断中的应用前景

实时荧光定量PCR技术是一种建立在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,它不仅实现了对DNA模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、实时性和准确性的特点,目前已广泛应用于基因表达、基因检测、单核苷酸多态性的测定、诊断遗传缺失、细胞因子的表达分析、动物疾病诊断等现代生物医学领域方面的研究。对实时荧光定量PCR技术的原理、技术发展、优缺点及其在蜜蜂疾病诊断中的应用与研究进展进行简要概述。     

实时荧光定量PCR技术及应用

实时荧光定量PCR技术是在常规PCR基础上发展起来的核酸定量技术,于1996年由美国Applied Biosystems公司推出.当前,实时荧光定量PCR技术应用范围很广,例如,能从粪便材料中分离出的细菌DNA来精确定量检测肠道菌,使我们能详细地分析肠道中优势菌与荧光原位杂交(FISH)及培养方法检测不到的非优势菌,为理解肠道菌群与机体状况关系提供重要线索.该技术从原理上分为荧光染料检测模式和荧光探针检测模式两方面.     

实时荧光定量PCR技术

荧光定量PCR技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的,具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单等优点,不但能够用于基因定量检测,还能准确定量疾病相关基因的表达,现已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、定量分析、早期诊断、基因分型等方面。它可以采用绝对定量和相对定量2种方式实现定量检测,但都有各自的优缺点,需根据具体的试验选择合适的定量方式,从而得到更准确的试验结果。提高荧光定量PCR技术的特异性和灵敏度需从多方面着手,主要指特异性探针及引物的设计,选择合适的Mg2 浓度、引物和探针浓度、循环数等。     

荧光定量PCR法检测饲料中的牛、羊成分

疯牛病是一种严重威胁畜牧业发展和人类生命安全的传染病，因此对于我们国家而言，急需建立一套严格，规范的检验标准，防止疫区的牛，羊肉骨粉通过直接或间接贸易进口，本文运用荧光定量PCR法，针对牛，羊两种不同动物的特异性基因序列设计带有不同荧光标记的特异性探针，对整个PCR过程采用实时监控，最终通过不同的荧光信息来鉴定饲料中的牛，羊成分。本方法能有效解决普通PCR的样品污染问题，具有特异性强，灵敏度高，重复性好等特点。     

饲料中鱼源性成分定量检测的实时荧光PCR技术的建立

根据鱼线粒体DNA(mtDNA)基因组序列,选择高度保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化,建立了饲料中鱼源性成分检测的实时荧光PCR方法.结果显示,应用该方法只能检测到鱼源性成分,表明该方法具有良好的特异性,对饲料中鱼源性成分的最低检出限为0.05%,定量检测的线性范围0.018～18.46ng.试验结果表明,该方法能对饲料中鱼源性成分进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高的优点,对防止饲料掺假、控制进出口饲料安全具有重要意义.     

实时荧光定量PCR技术及在猪重大疫病中的诊断应用

实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescent quantitative PCR．FQ-PCR）是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术具有操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、快速高效、全封闭...     

实时荧光定量PCR技术原理与应用

实时荧光定量PCR(real-ti me fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术,它具有特异性强、PCR污染少、自动化程度高等特点。作者就实时荧光定量PCR技术的主要原理及目前在分子生物学领域,病原体和肿瘤等方面的检测和诊断应用进行了概述。     

荧光定量PCR技术在疾病检测上的应用

实时荧光定量PCR技术融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,以直接探测PCR过程中荧光信号的变化获得定量的结果。因其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,成为当前疫病检测广泛采用的分子生物学诊断技术。本文就实时荧光定量PCR技术在疾病检测上的应用作一综述。     

检测猪戊型肝炎病毒的荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中猪戊型肝炎病毒的ORF2核苷酸序列的保守区域设计合成一对特异性引物,建立了一套SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR检测猪源戊型肝炎病毒(swHEV)的方法,并评价了该方法的灵敏度、稳定性和特异性,同时与常规的RT-nPCR进行对比分析.结果表明,建立标准曲线的相关系数为0.998,斜率为-3.039,Ct值变异系数(CV)在0.17％～1.41％之间,有良好的稳定性.同时在检测猪群常见病中显示出很好的特异性,并且比RT-nPCR更灵敏,适合于swHEV的检测.     

1株禽传染性支气管炎病毒的分离鉴定及其实时荧光定量PCR检测方法的建立

自禽传染性支气管炎病毒流行较严重地区的患鸡组织病料中分离得到1株疑似毒株,利用鸡胚培养、气管环及动物回归试验、电镜观察、RT-PCR等多种方法及对其S1基因序列进行比较分析,确定该分离毒株为禽传染性支气管炎病毒QX型。同时针对该新分离的传染性支气管炎病毒建立了实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:针对该分离毒株的S1基因区设计1对引物和TaqMan探针,制备质粒标准品,建立标准曲线,其线性关系为y=-3.385 7x+42.235,R^2=0.999,扩增效率为97.5%,该法能区分常见禽类流行病毒,检测灵敏度可达42.1拷贝数/μL,比普通PCR检测限度高,重复性良好,因而该实时荧光定量PCR检测方法可靠。本试验同时进行了拷贝数与半数鸡胚感染量(EID50)对应关系研究,证明了在控制病毒代次、冻融次数等条件下,建立线性关系为y=0.249 2x+1.341×10^6(以拷贝数为x轴,EID50为y轴),R^2=0.956 4,可实现拷贝数替代EID50。     

应用荧光定量PCR筛选绵羊肺炎支原体最适生长培养基

为筛选绵羊肺炎支原体(Mo)最适生长培养基,针对Mo 16S rRNA基因设计特异性引物FQs/FQa,建立可定量检测Mo 16S rRNA基因FQ-PCR方法,通过检测不同培养时间各Mo培养液中Mo Y98株核酸含量,比较Mo于不同培养基中培养特性,以筛选Mo最适生长培养基。结果,以Broth-ame与TSB1培养Mo 7,10和14 d时Mo核酸检测值较高,较Frey-ame、PPLO-ame更适合Mo生长。本研究为后续Mo生物学特性分析奠定了基础。     

实时荧光定量PCR检测猪细小病毒

根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了引物和探针,从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明目的片段已经成功克隆.将104～108拷贝反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度为102拷贝.本方法的建立为猪细小病毒感染的早期诊断奠定了基础.     

副猪嗜血杆菌及巴氏杆菌双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立副猪嗜血杆菌(Hps)、多杀性巴氏杆菌(Pm)的双重荧光定量PCR检测方法,本研究基于Hps的Omp P2基因,Pm的PlpE基因设计两对特异性引物及探针,通过对反应条件优化,建立了一种同时检测Hps及Pm的双重荧光定量PCR方法。该方法能够特异性地检测Hps和Pm,其对重组质粒标准品的最低检测浓度分别为5.60×10^2拷贝/μL、7.58×10^2拷贝/μL。双重与单一荧光定量PCR最低检测限相同,且均是常规PCR的100倍。重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于2.5%。临床应用结果显示:该方法对阳性样品的检出率为53.57%,明显优于常规PCR和细菌分离鉴定。该方法能够用于两种疾病的同时检测和快速排查疾病。为两种疾病的防治提供有效检测工具。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列,设计了一对特异性引物和探针,使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法。结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性。     

实时荧光定量TaqMan-PCR检测鸭瘟病毒方法的建立

根据GenBank中鸭瘟病毒UL6和UL7基因的序列,设计了一对特异性引物及TaqMan探针,扩增位于UL6和UL7基因第891￣991位长度为101bp片段。以DPV标准强株DNA为模板,建立了实时荧光定量PCR检测鸭瘟病毒的方法。该方法只能在鸭瘟病毒DNA样本中检出荧光信号,最小检出量为1.57×102copies(23.7fg);线性范围达8个数量级;平行复管检测,组内变异系数为0.84%(n=20),同一组样本(n=6)间隔30d重复检测,结果无显著性差异;对试验感染鸭肝脏和脑组织中鸭瘟病毒的检出率为100%(40/40),对临床病例的检测结果与病毒分离鉴定结果一致;从核酸提取到报告检测结果仅需3h;对鸭正常组织、鸡传染性喉气管炎病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸡源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭副伤寒沙门氏菌等非鸭瘟病毒DNA检测,不出现非特异性荧光信号。     

猪圆环病毒Ⅰ型荧光定量PCR检测方法的建立

以定量的10倍系列稀释的质量pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了PCV1检测的荧光定量PCR方法.结果表明该方法检测灵敏度可达1.0×104拷贝/μL,线性范围为1010～101;对起始浓度为1.0X107、1.0×106、1.0×106拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.001×107、0.869×106和0.988×105拷贝/μL,变异系数分别为4.758%、1.865%和3.836%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR(nPCR)具有相近的灵敏度.