火龙果DREB1D基因的克隆及在转基因拟南芥中的功能分析

【目的】DREB(dehydration responsive element binding)是一类脱水响应元件结合蛋白,在植物响应高温、干旱、高盐和低温等多种非生物胁迫过程中发挥关键作用。以紫红龙火龙果（Hylocereus monacanthus）为材料,克隆得到DREB转录因子,并命名为HmDREB1D(HU02G01866.1),探究其生物学功能。【方法】构建HmDREB1D基因植物过表达载体,通过亚细胞定位分析HmDREB1D基因在细胞中的位置。异源转化拟南芥,对T3代纯合系转基因拟南芥（OE3、OE4、OE5）进行生物学功能验证。【结果】火龙果HmDREB1D基因的开放阅读框全长723 bp,产生的蛋白定位于细胞核内,属DREB1s亚家族,具有典型的AP2结构域。将HmDREB1D基因转化至拟南芥获得超表达转基因株系,与野生型相比,转基因株系表现出较高的抗逆性。在干旱胁迫下,转基因植株T3代纯合系种子的萌发率高于野生型。转基因植株的叶片在逆境胁迫下表现出更低的电导率及更高的保护性酶活性。实时荧光定量PCR分析显示,RD20、HSP70和COR15A等逆境胁迫响应基因在Hm...     

‘秦冠’苹果MdWRKY基因亚细胞定位及原核表达

 以‘秦冠’苹果为试材,采用RT-PCR方法获得了一个WRKY基因,全长1 224 bp,推断其编码331个氨基酸,命名为MdWRKY。亚细胞定位分析MdWRKY蛋白分布在细胞核内,属于核蛋白。实时定量分析结果显示,MdWRKY基因受苹果斑点落叶病菌的诱导,表明其可能参与植物与病原菌的互作。随后进行原核表达分析,SDS/PAGE电泳结果表明表达蛋白与其蛋白大小一致。     

桃乙烯应答因子PpERF1a的克隆与功能分析

以‘丰光’油桃嫩梢组织为试材,克隆了1个ERF家族基因并命名为PpERF1a(ppa018178m)。该基因全长为600 bp,编码199个氨基酸,含有1个典型的AP2结构域。亚细胞定位结果显示PpERF1a定位于细胞膜和细胞核。在拟南芥中超量表达PpERF1a,共获得15个阳性转基因株系。与对照相比,转基因植株出现发育不良的表型,其中6株持续长出莲座叶,但不抽薹;6株能够抽薹开花,但不结实且生长势明显弱于对照;3株能够开花结实,但种子产量极低。这些结果表明PpERF1a在转基因拟南芥中具有调控生长发育的功能,为后期在桃中开展PpERF1a的功能研究提供了有益的启示。     

苹果MdDRB1的表达与功能分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为试材,扩增Md DRB1基因,分析其序列结构,同时原核诱导Md DRB1蛋白并观察其亚细胞定位。利用q RT-PCR检测Md DRB1在非生物胁迫下的表达量,通过遗传转化苹果苗鉴定Md DRB1在非生物胁迫中的功能。基因结构分析显示,Md DRB1具有2个内含子和3个外显子。亚细胞定位显示,Md DRB1主要定位于细胞核,少数定位在细胞质。原核诱导结果显示,Md DRB1融合蛋白以包涵体的形式存在。同时发现Md DRB1反义转基因愈伤中与抗性相关的mi RNA的表达水平上调。在PEG、ABA、盐和低温处理的材料中Md DRB1的表达水平明显上调。另外,Md DRB1过量表达明显提高了转基因苹果组培苗的抗性。推测Md DRB1在抗逆胁迫响应中有重要作用。     

苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果基因MdMYB2(基因序列号:MDP0000823458)。MdMYB2的开放阅读框(ORF)长度为873 bp,编码含有290个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为32.92 kD,等电点为4.91。系统进化树分析显示,苹果MYB2与梨MYBL2亲缘关系最近,同源性最高。组织表达分析表明,MdMYB2在苹果的各个组织均有表达,在茎和果实中表达相对较高。MdMYB2的表达明显受盐胁迫的诱导。构建了MdMYB2的表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化得到了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥植株。抗性试验表明,过量表达MdMYB2明显提高了转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。此外,异位表达MdMYB2也能提高拟南芥对盐胁迫的抗性,以上试验结果表明MdMYB2在植物盐胁迫响应中发挥重要作用。     

月季抗白粉病基因RhMLO的亚细胞定位及功能分析

MLO是一类新发现的抗病基因,一些双子叶植物隐性突变的mlo基因使其获得了广谱高抗的抗病性。通过生物信息学分析结合亚细胞定位试验,对前期克隆获得的月季MLO进行亚细胞定位,结果表明,RhMLO1和RhMLO2均为主要分布于细胞质膜、液泡膜和细胞核的跨膜蛋白,与预测结果相符。构建了RhMLO1的正义表达载体,通过农杆菌介导法对月季‘白玉’植株体细胞胚进行遗传转化。利用PCR法和荧光定量PCR法对转基因植株进行分子检测,表明基因已经整合到转基因植株中。分别利用离体鉴定法和显微镜观察法对转基因植株和对照植株进行对白粉病菌(Podosphera pannosa)抗性鉴定,结果一致显示:正义载体的导入降低了转基因植株对白粉病的抗性。     

苹果MdCBL3基因的克隆与功能鉴定

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆MdCBL3(序列号:MDP0000155124),长852 bp。系统进化树分析表明,苹果MdCBL3与白梨亲缘关系最近。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件预测分析,MdCBL3启动子序列中存在干旱、低温、光、生长素、防御等响应元件。构建MdCBL3表达载体并利用农杆菌介导法侵染苹果愈伤组织和拟南芥。半定量RT-PCR证明MdCBL3在转基因愈伤组织中过量表达,在拟南芥中得到异源表达。表型分析发现,在盐胁迫中,与野生型相比,转基因愈伤组织和拟南芥成龄苗生长更好,盐胁迫的抗性更强。在拟南芥中异源表达MdCBL3,能提高拟南芥对干旱和低温的抗性。     

苹果MdNAC143的克隆及其在苹果愈伤组织的抗盐功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个NAC转录因子基因MdNAC143(序列号:MDP0000334047),其开放阅读框为924 bp,编码308个氨基酸,预测蛋白质的分子量为35.59 k D,等电点为6.32。结构域分析表明,MdNAC143蛋白N端含有保守的NAC结构域。酵母双杂交结果表明MdNAC143的全长及C端具有转录激活活性。荧光定量PCR分析表明,MdNAC143在苹果的各个组织均有表达,其中在叶片和花中表达相对较高;MdNAC143的表达明显受盐胁迫的诱导。将MdNAC143遗传转化‘王林’苹果愈伤组织,进行抗盐表型鉴定后发现,MdNAC143在愈伤组织中过量表达后能明显提高对盐胁迫的抗性。     

菠萝AcZFP1的克隆及其在低温胁迫下的功能分析

以‘神湾’菠萝为材料,克隆了1个C2H2型锌指蛋白基因,命名为AcZFP1,其开放阅读框为816bp,编码271个氨基酸,含有2个典型的锌指蛋白结构域。进化树分析表明AcZFP1与水稻Os ZFP252和OsMSR15的亲缘关系最近。基因表达分析发现,AcZFP1受低温、NaCl和聚乙二醇（PEG）干旱等多种逆境胁迫及外源ABA、SA和MeJA的诱导。试验表明,AcZFP1蛋白定位于细胞核中。AcZFP1过表达的拟南芥株系在低温处理后相比野生型对照有更高的成活率和Fv/Fm值,可溶性蛋白含量增加,SOD、POD酶活增强,MDA含量降低,植株的耐寒性显著增强。进一步的qRT-PCR分析显示,AcZFP1可以促进AtRD29A、AtCOR47等4个典型的拟南芥内源冷应答基因的表达,在低温胁迫中发挥正调控作用。     

苹果砧木耐盐性田间鉴定

1997～ 1998年在山东省东营市盐碱地农场分别种植 14种 1年生苹果砧木苗和 6种砧木的1年生嫁接苗 ,发现砧木珠美海棠 ( Malus　 zumi)、小金海棠 ( M.xiaojinensis)耐盐性较强 ;M2 6、MM10 6、M9、八棱海棠 ( M.micromalus)耐盐性中等 ;丽江山定子 ( M.rockii)和 A2不耐盐。不同砧穗组合的耐盐能力主要取决于砧木 ,同一种砧木嫁接不同品种的耐盐性相当。轻度盐碱地育苗、覆膜铺草等栽培措施能提高苹果苗对盐胁迫适应性能力     

苹果MdGA20ox1 基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

 以苹果砧木SH40[（Malus × domestica）× M. honanensis]为试材,采用RT-PCR 结合RACE 技术从SH40 茎尖中克隆得到一个赤霉素合成关键酶基因（GA20–氧化酶基因）,命名为MdGA20ox1, 其cDNA 全长1 579 bp,编码392 个氨基酸。该基因在GenBank 登录号为KC493633。氨基酸序列同源性 分析表明：MdGA20ox1 与玉米、拟南芥、梨等植物GA20ox 具有55.9% ~ 96.7%的相似性。洋葱表皮细 胞瞬时表达显示,MdGA20ox1 蛋白定位于细胞核与细胞质膜。植株生长量测定和相对定量表达结果表明, MdGA20ox1 基因在砧木SH28、SH40 和M26 自根苗的表达呈先下降再上升然后下降的趋势,这与其生长 动态基本一致。嘎啦/SH28 的植株生长量和MdGA20ox1 表达量最高,嘎啦/M26 次之,嘎啦/SH40 最低, 初步表明该基因的表达有与苹果植株矮化程度呈负相关的趋势。MdGA20ox1 在嘎啦/SH40 和嘎啦/SH28 不同组织中的表达模式一致,且半矮化类型砧木SH28 嫁接‘嘎啦’,其茎尖、幼叶、成熟叶和枝皮中的 表达量均高于矮化类型SH40 嫁接‘嘎啦’。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

绢毛委陵菜PsWRKY40的克隆与耐镉功能分析

以绢毛委陵菜(Potentilla sericea)为材料,克隆得到PsWRKY40的c DNA全长序列。该基因的开放阅读框长978bp,编码325个氨基酸,属于WRKY家族GroupⅡ亚族。荧光定量PCR分析表明,PsWRKY40被NaCl、CdCl₂和甘露醇显著诱导表达。将PsWRKY40异源转化拟南芥,转基因植株在镉处理后,其对Cd的抗性显著高于野生型植株,AtSOD、AtPOD和AtCAT的表达量显著提高。上述结果表明PsWRKY40可被镉诱导,可能参与绢毛委陵菜抗镉调控。     

石榴花青苷合成相关基因PgMYB111的克隆与功能分析

为研究R2R3-MYB转录因子调控石榴花青苷合成的机理,以石榴品系‘榴花红’（红花）和‘榴花白’（白花）为试材,利用同源克隆技术分离出1个调控花青苷生物合成的R2R3-MYB基因PgMYB111(Pg012177.1)。其CDS全长为1 101 bp,编码366个氨基酸。多重比对分析表明,PgMYB111蛋白的N端含有1个R2R3保守结构域,以及1个与bHLH蛋白互作的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结合位点。系统发育树分析表明,PgMYB111与苹果和扁桃具有较高的同源性,聚为一簇。亚细胞定位试验发现,PgMYB111定位于细胞核。PgMYB111在‘榴花红’中的表达量是‘榴花白’的4.3倍,且‘榴花红’花瓣花青苷含量也显著高于‘榴花白’。烟草瞬时表达结果表明转基因烟草叶片的花青苷含量和基因表达量呈先上升后下降的趋势,均在第5天达到最高,分别是未侵染叶片的3.8倍和8.9倍,pBI121空载叶片的3.17倍和5.57倍。结果表明PgMYB111参与了花青苷合成途径并促进其合成。     

葡萄转录因子VpSBP12的克隆及功能分析

以华东葡萄‘白河-35-1’为试材,依据葡萄全基因组数据库(http://www.genoscope.cns.fr),利用同源序列比对结果设计引物,克隆获得VpSBP12基因的DNA和cDNA序列,并分析其序列特征和表达特性,以期阐明其在葡萄抗盐胁迫中的作用,为葡萄抗逆育种提供参考依据。结果表明:VpSBP12基因DNA全长2 907bp,其中含有3个外显子和2个内含子;该基因的完整开放阅读框序列全长1 137bp,编码379个氨基酸,其中包括一个含有双向核定位信号的高度保守SBP结构域。经过亚细胞定位和转录活性分析表明,该基因可以定位到核里,且具有转录激活活性。构建过量表达载体将VpSBP12转化拟南芥后发现,转基因株系在盐胁迫培养基上的萌发率及根长显著高于野生对照。表明VpSBP12基因在拟南芥中的过量表达提高了植株的抗盐胁迫的能力。     

苹果POD家族基因的鉴定与MdPOD15的功能分析

为探究苹果过氧化物酶（POD）基因家族成员在苹果逆境下的作用,利用已报道的拟南芥POD基因,通过多序列比对鉴定出51个苹果POD(MdPOD)家族成员,并分析其在逆境条件下的表达规律。结果表明51个家族成员分布于13条染色体上,其编码95～1 443个氨基酸,蛋白分子量为10.18～161.02 kD,等电点为4.36～9.90。分析表明该基因家族可分为6个亚族,外显子数介于1～40。选择压分析表明20个基因在进化过程中受到纯化选择作用。亚细胞定位发现MdPOD15主要存在于细胞膜、细胞质、细胞核和叶绿体中。基因芯片表达图谱显示大部分MdPOD在花、叶和果实中表达量较高。实时荧光定量PCR表明,ABA处理2 h大部分基因的表达量上调,之后出现下降,PEG处理12 h后51个MdPOD基因表达量达到峰值,而用NaCl处理时MdPOD的表达量到24h时达到峰值。烟草叶片瞬时表达MdPOD15发现,其在细胞膜、细胞质和细胞核中表达,且苹果愈伤组织中MdPOD15的超表达可缓和非生物胁迫对细胞的损伤程度,由此可知MdPOD在不同非生物胁迫下的不同时间段可能发挥不同的作用。     

中国野生燕山葡萄VyCIPK9基因的克隆与功能分析

【目的】类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶（CBL-interacting protein kinase,CIPK）是一类丝氨酸/苏氨酸激酶,在干旱、低温等非生物逆境的信号传递中起着重要的作用。以中国野生燕山葡萄（Vitis yeshanensis‘Yanshan’）为材料,筛选到1个CIPK转录因子,暂命名为VyCIPK9（登录号：MK942080）,探究其特性与功能。【方法】利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析Vy CIPK9基因在葡萄不同组织器官及不同诱导下的表达模式,同时构建VyCIPK9基因植物表达载体,将VyCIPK9基因转化到烟草中,探究盐胁迫处理下VyCIPK9基因过表达对转基因烟草种子、幼苗和植株生长发育及其生理特性的影响。【结果】VyCIPK9基因在葡萄不同组织器官中特异表达,主要在老叶中高度表达;VyCIPK9基因对吲哚乙酸（indole acetic acid,IAA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）诱导和盐胁迫响应强烈;在盐胁迫条件下,VyCIPK9转基因烟草种子发芽率均比野生...     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。     

NaCl胁迫对苹果属植物矿质营养吸收的影响

Na Cl胁迫对作物的危害方式主要有三种 :一是离子毒害 ,土壤中含盐量高时 ,作物吸收盐分并在体内积累造成盐害 ;二是营养胁迫 ,Na Cl使许多作物细胞内 K 、Ca2 含量下降 ,导致作物缺乏某些元素而引起生长发育障碍 ;三是渗透胁迫 ,盐胁迫使根际水势降低 ,当其接近或低于细胞水势时 ,根吸水就会受到抑制 ,甚至发生水分倒流 ,原生质体失水收缩死亡。本试验通过对八棱海棠、山定子、小金海棠、珠眉海棠在 Na Cl胁迫条件下吸收利用矿质营养特性的研究 ,以探讨 Na Cl胁迫对苹果属植物生长发育的营养生理机制。1　材料与方法1 .1　试验材料　…     

柑橘菌根信号受体蛋白基因LYK2的克隆及功能分析

从甜橙基因组中鉴定到12个菌根信号受体蛋白基因CsLYK,分布于chr1、chr2、chr6、chr7、chr8和chr9等6条染色体上.结构域分析表明CsLYK家族基因的3,端含有7个保守motif,且其组合也高度保守;而5'端仅有3个保守motif,且其组合变异较大.另外,CsLYK2、CsLYK3、CsLYK6、...