基于重测序的‘金兰柚’基因组InDel标记的开发及应用

基于重测序进行金兰柚全基因组InDel标记开发。利用二代测序技术对‘金兰柚’进行全基因组重测序,运用BWA软件将测序得到的片段与参考基因组序列进行比对,利用严格的参数筛选杂合InDel,结合Primer 3.0设计扩增引物,进行PCR扩增并利用琼脂糖凝胶电泳验证,以重测序材料‘金兰柚’和47份柚品种检测其有效性。在全基因组范围内共筛选出81对扩增条带清晰的引物。筛选出的多态性标记涵盖了整个‘金兰柚’基因组,平均每条染色体上9个。选取的24对InDel标记可以将48份柚品种有效区分,最少使用2对引物就可将‘金兰柚’与其他47份柚品种完全区分。利用UPGMA构建48份柚品种的聚类树状图,在遗传相似系数为0.611的阈值处可将48个柚品种分为3大类群。本研究中的InDel标记带型简单易读,适宜柚DNA指纹图谱构建和品种鉴定,可为柚名优品种保护、原产地溯源管理等提供科学依据。     

茄子全基因组InDel变异特征及分子标记开发和应用

选取4份圆茄(Solanum melongena L.)高代自交系进行全基因组重测序,鉴定出145 407个InDel,12号染色体InDel数最少(7 752),1号最多(19 738)。筛选出7 959个长度大于10bp的InDel位点,挑选均匀分布在基因组上的144个设计InDel引物并进行验证。利用26份茄子材料对144对InDel引物进行筛选,63对表现出稳定的多态性,比例为43.75%;主要等位基因频率为0.4038～0.9808,平均为0.7659;基因多样性指数(H_s)为0.0377～0.6501,平均为0.3217;多态性信息含量(PIC)为0.0370～0.5750,平均为0.2663,42个标记多态性信息含量大于0.200,多态性较好。当遗传距离为0.235时,将26份不同类型的茄子材料划分为2个类群。利用多态性信息含量高的前10个InDel标记构建了26份茄子材料DNA指纹图谱。另外,选择在亲本间具有多态性的InDel标记用于4个杂交组合的F₁代真实性鉴定,鉴定结果表明3个为真实杂交种,与田间鉴定结果吻合。     

白菜型油菜和菜薹的InDel 标记开发及其RILs群体遗传连锁图谱的构建

 通过白菜型油菜‘R-O-18’和菜薹‘L58’的基因组重测序数据与白菜基因组的参考序列（‘Chiifu-401-42’的基因组序列）的比对,在全基因组范围内检测到了18 479 个短插入缺失变异位点（≤5 bp）。从中挑选了500 个插入/缺失片段为4 ~ 5 bp 的InDel 变异位点,将其设计成InDel 分子标记并进行试验验证,结果有452 个标记通过PCR 扩增出单一条带,但仅有106 个在‘R-O-18’和‘L58’间表现出多态性,346 个没有多态性,48 个在PCR 中没有扩增。亲本间具有多态性的106 个InDel 标记可用来检测以‘R-O-18’和‘L58’为亲本构建的RILs 基因型,并构建了一张包含99 个标记的遗传连锁图谱。     

苹果抗炭疽菌叶枯病基因SNP和InDel标记的HRM筛选

以207株‘金冠’与‘富士’苹果的F1杂交分离群体实生树为试材,挑选抗炭疽菌叶枯病基因R_(gls)位点区域内的,第15条染色体上,位于SSR标记S0304673和S0405127之间500 kb物理距离内,由全基因组重测序技术所获得的与抗该病相关的10个SNP及10个InDel标记,通过高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)技术筛选出与基因R_(gls)位点紧密连锁的2个SNP及4个InDel标记。通过对重组个体的基因型及表型分析,发现标记InDel4227和InDel4254表现出与R_(gls)基因位点共分离,将基因R_(gls)精细定位于标记InDel4199和SNP4299之间100 kb的物理距离内。对该基因位点两侧4.1~4.3Mb距离内的基因进行统计分析,表明在该区段内存在40个有功能注释的基因,涉及到细胞组成、分子功能和生物过程方面共19个GO分类。     

基于基因组重测序数据高效筛选梨SSR标记多态性引物

【目的】基于重测序数据开发一种快速筛选样品间SSR标记多态性的方法。【方法】通过基因组重测序技术对2个砂梨品种'早生新水’和'秋水’、1个西洋梨栽培品种'早红考密斯’以及3个梨属野生种豆梨、川梨和杜梨进行重测序,对已报道的446对梨SSR引物和新开发16对引物进行多态性测试,使用Magicblast匹配测序产生的Reads到上述SSR位点序列,获得SSR两侧保守序列之间的长度,筛选出多态性的引物。使用荧光PCR对部分筛选出的多态性引物进行验证。【结果】单个SSR位点在不同样品间获得匹配的平均Reads数能够超过16条,每个样品均获得了220个以上位点的信息,380对引物在不同样品间能够获得多态性的片段。精确分析了梨LG3早熟候选区域29个SSR位点在'早生新水’和'秋水’中的扩增情况,共鉴定出9个多态性表现好的位点。荧光PCR验证结果显示,通过预备筛选的引物表现出良好的多态性。【结论】本研究的方法一次能够筛选多对SSR引物,在常规PCR前可以预先获得不同引物的多态性信息,从而提高引物筛选效率。本方法不仅能应用于梨重测序数据快速筛选SSR引物,对其他动植物上的类似研究同样适用。     

应用InDel标记进行软枣猕猴桃杂交子代真实性鉴定

【目的】对杂交后代进行真实性鉴定是进行猕猴桃分子遗传学研究的前提。通过筛选InDel引物对软枣猕猴桃2个杂交后代群体进行InDel标记研究,以鉴定杂种后代的真实性。【方法】采用高通量磁珠法提取软枣猕猴桃‘永丰1号’(♀)、‘RB-3’(♀)、‘11-17’(♂)、‘魁绿雄’(♂)亲本基因组DNA,以及‘RB-3’ב魁绿雄’子代175株和‘永丰1号’ב11-17’子代531株的基因组DNA;根据重测序数据设计InDel引物,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳在4个亲本中进行多态性验证,选择扩增带型清晰、稳定以及在父本中出现特异性条带的引物用于杂种子代鉴定,根据所选引物中InDel片段长度选择琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳,对‘RB-3’ב魁绿雄’和‘永丰1号’ב11-17’2个杂交F1代群体进行真实性鉴定。【结果】在‘RB-3’ב魁绿雄’的杂交组合中,共筛选出4对引物,作为杂种鉴定的标记,鉴定杂交后代的真杂种比率为92.00%。在‘永丰1号’ב11-17’杂交组合中,同样筛选到4对,杂交后代的真杂种比率为99.24%。【结论】InDel标记可有效地对猕猴桃杂交后代进行真实性鉴定,真杂种的鉴定为后续的分子标记辅助育种、遗传图谱构建等奠定基础。     

‘惠水金橘’的叶绿体基因组特征分析

【目的】分析贵州地方柑橘品种‘惠水金橘’的叶绿体基因组特征及分子标记,为研究该品种的系统进化关系、丰富柑橘类果树叶绿体分子标记奠定基础。【方法】提取‘惠水金橘’成熟叶片总DNA,构建小片段插入文库并测序,以甜橙叶绿体基因组为参考,筛选叶绿体基因组相关序列组装,开展SSR(simple sequence repeat,简单重复序列)预测、SNP(single nucleotide polymorphisms,单核苷酸多态性)/InDel(insertion-deletion,插入缺失)分析以及聚类分析。【结果】组装后获得叶绿体基因组全长为160 698 bp,GC含量为38.42%,共有117种基因被注释;检测到92个SSR位点,大部分的SSR位点都偏向于A/T组成;检测到417个SNPs位点、149个InDels位点、InDel的标记密度约为每kb 0.927个。进化树显示该品种与其他宽皮柑橘聚为一大类。【结论】利用高通量测序技术挖掘柑橘叶绿体基因组DNA分子标记是可行的。     

磁珠富集法分离菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus)微卫星标记及系列分析

利用磁珠富集法分离出菠萝蜜微卫星位点,并成功设计出菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.)SSR(简单序列重复,Simple sequence repeat)分子标记引物。基因组DNA经MseI酶切后,用生物素标记的简单重复序列做探针与其杂交,杂交复合物固定到包被有链霉亲和素的磁珠上,经过一系列的洗涤过程,含有SSR的酶切片段被吸附到磁珠表面。这些片段经洗脱下来后,先用对应的引物扩增,再进行克隆和测序。实验共挑出83个阳性克隆进行测序,成功设计合成SSR引物19对。并通过这19对SSR引物对20份菠萝蜜种质资源进行分析,全部能扩增出特异性条带,其中18对引物扩增的条带具有多态性,可以作为菠萝蜜分子标记使用。     

中国樱桃InDel标记开发及其在蔷薇科果树中通用性评价

对栽培和野生中国樱桃进行De novo基因组测序和比对,在全基因组范围内检测筛选出50 617个InDel位点,并挑选均匀分布的200个标记进行验证,其中,27个标记在中国樱桃种内表现出多态性。利用多态性标记,对不同来源的192份中国樱桃（168份栽培和24份野生）种质进行基因型分型,共检测到60个等位基因（N_a）,平均每个标记2.2个;基因多样性指数（H_s）为0.010 ~ 0.500,平均0.239;多态性信息含量（PIC）为0.010 ~ 0.375,平均0.198,表明中国樱桃遗传基础相对狭窄。根据聚类结果和地理分布将192份中国樱桃种质大致划分为5个群体。筛选出在蔷薇科李亚科樱属、李属、桃属、杏属、苹果亚科梨属、苹果属和蔷薇亚科草莓属、悬钩子属等重要果树共8个属156个个体中表现出较好通用性标记34个。物种与中国樱桃亲缘关系越近,InDel标记的多态性越高。     

大白菜自交系背景选择InDel标记与重要农艺性状的关联分析

InDel背景选择标记有利于大白菜育种亲本的高效选配。以31份不同类型大白菜自交系为材料进行农艺性状变异分析、InDel标记遗传背景和群体结构分析,并将多态性标记与农艺性状相关联。结果显示,31个农艺性状的变异系数变幅为15.97%～47.63%,平均为32.58%,表明供试群体表型变异丰富;从177对InDel引物中筛选出158对多态性引物,在31份材料中共检测出701个多态性等位变异位点,平均每对引物检测到等位变异位点4.418个,变幅为1～11个;标记位点的多态性信息含量(PIC)变幅为0.612～0.963,平均为0.843;有效等位基因变异数(Ne)变幅为1.656～3.985,平均为2.640;供试材料遗传相似系数(GS)在0.575～0.910之间,变化幅度较大,说明群体的遗传背景具有较大差异。群体结构分析将供试材料划分为3个亚群;关联分析发现分布于8个连锁群的22个InDel标记与供试材料的12个农艺性状(开展度、全株质量、球叶数、外叶数、叶片宽、叶片长、叶球高、叶球宽、叶球质量、中肋长、中心柱长和株高)相关。     

基于InDel标记的大白菜育种材料分子身份证构建

以105份大白菜育种材料为试材,精选20对均匀分布于大白菜基因组、且只能检测出2个等位基因的共显性InDel标记引物进行分子标记检测,构建分子身份证。结果表明:20对引物中有16对引物在所有材料中均扩增出单一条带,另外各有2对引物在部分材料中存在缺失和加倍现象。将所有标记引物按其所处染色体编号由小(A01)到大(A10)排列,同一染色体上的标记则按照物理位置从小到大排列,按顺序对标记赋值,构建了105份大白菜材料的分子身份证。所筛选的20对引物对未知新种质的身份证构建具有通用性和兼容性,表明InDel标记技术可以作为大白菜鉴定和分子身份证构建的有效技术手段。     

金针菇基因组SSR位点分析及标记开发

以金针菇(Flammulina velutipes)基因组序列为基础,对其SSR位点进行分析,设计16对引物对其中16个SSR位点进行标记设计,并对6个商业化的金针菇品种进行筛选.统计结果表明,金针菇基因组有1279个位点,SSR位点密度为35.53/Mb,并以三核苷酸基序为主,重复数≥10的SSR(即高频)基序数目总计246个,占所有SSR位点的19.23％.设计的16对SSR标记均能扩增条带,多态率仅为18.75％.     

菜瓜×马泡瓜遗传连锁图谱构建及果实相关性状QTL分析

试验用果实相关性状差异显著的两个亲本,菜瓜(Cucumis melo ssp.melo var.flexuosus)品系M4-75 (长型、肉厚)为母本和马泡瓜(C.melo ssp.agrestis)品系X207 (小果、圆形、肉薄)为父本,进行基因组重测序,并以此双亲配制F_2群体,进行CAPS标记的开发、遗传连锁图谱的构建和甜瓜果实相关性状的QTL分析。共筛选出180对具有多态性的引物,并得到一张遗传连锁图谱,该图谱包含165个CAPS标记、12个连锁群,覆盖基因组长度1 019.81 cM,标记间平均距离为6.18 cM。试验结果表明甜瓜果实相关性状均为数量性状,并检测到与之相关的QTL共14个,分布在第1、2、3、4、5、6、7、10和11连锁群上,LOD值介于2.67～9.63,可解释7.60%～35.18%的表型变异率,其中果实形状相关位点有9个,果肉厚度相关位点有3个,pH相关位点有2个。     

枇杷全基因组SSR标记开发及其多态性研究

搜索枇杷全基因组范围内的SSR位点,分析其分布特点,同时使用10个枇杷品种的重测序数据对这些位点的基因型进行分析。结果显示共获得103509个SSR位点,二核苷酸重复类型有73604个,占71.1%,以AT/TA为主。三核苷酸重复类型占15.0%,以AAG/CTT为主。对10个枇杷样本进行重测序,分别获得32～206 Mb的reads,测序深度为12.9×～81.3×。本研究中新开发2个脚本程序(Flank和SSRtype),对重测序数据Reads中包含的SSR位点长度进行了分析,确定基因型。‘早钟6号’的测序深度达到12.9×,能够覆盖80%的SSR位点,说明12×以上的测序深度能够满足SSR位点的分析。枇杷中大量SSR位点为多拷贝(占78.4%),为单个品种单个位点产生3条以上的条带,而在所有品种中呈现两拷贝的SSR位点有12 962个(占12.5%),这些位点产生的多态性条带分别为2～10条不等,多态性信息含量的中位数为0.269,大于0.5的位点有526个。从中挑选20对引物进行荧光PCR,结果显示这些引物的多态性与重测序分析结果一致。     

基于基因组结构变异构建萝卜种质资源分子身份证

萝卜种质资源类型多样,难以通过表型评价判定其亲缘关系.本试验整合4份萝卜全基因组重测序数据和520份萝卜简化基因组测序数据进行生物信息学分析,鉴定了萝卜群体基因组水平的结构变异,开发了24个通用性的分子标记.使用上述标记对255份萝卜种质进行基因分型,构建了相应的萝卜分子身份证.聚类分析结果表明,在相关系数0.55处可...     

26份椪柑资源遗传多样性分析

利用SSR和InDel分子标记对来自不同国家与地区的26份椪柑资源进行了遗传多样性分析。21对引物共获得62个标记位点,产生了105条多态性条带。多态性标记位点的平均PIC值为0.32,平均期望杂合度为0.30。群体遗传结构和主坐标分析均表明,椪柑资源内部遗传多样性水平低,遗传变异较小。印度酸桔与椪柑遗传关系较远;Emperor、濑户见及早香等椪柑杂交后代,与椪柑存在明显遗传差异。采用筛选的分子标记组合(SSR14、SSR16、InDel2、InDel6、SSR5和SSR20)可有效鉴别椪柑材料。     

基于InDel标记的杏鲍菇遗传多样性评价

插入/缺失（insertion-deletion,InDel）标记作为快速鉴定品种间遗传多样性的方法之一,因具有对检测设备要求低、简单易行、成本低,且共显性遗传、变异稳定、准确性高、重复性好等特点,在医学、动植物遗传学的群体遗传分析、基因定位及遗传图谱构建等领域被广泛应用。为评价我国杏鲍菇菌株的遗传多样性,加快杏鲍菇遗传育种工作进程,通过比对杏鲍菇已公布的基因组组装数据,开发30～200 bp InDel标记便于常规电泳检测,随机选取合成36对引物对收集自国家食用菌标准菌株库、国内企业和市场的65份杏鲍菇菌株进行验证,筛选出25对有效引物,进行遗传多样性分析并构建UPGMA聚类树。结果表明,65份供试菌株遗传多样性丰富,遗传相似系数最低为0.362,在相似系数0.616时可分为5个类群。     

基于万寿菊转录组测序的SSR标记开发

万寿菊（Tagetes erecta L.）花蕾转录组测序共获得48 953条Unigene,利用MISA软件检测出20 666个SSR位点,分布于13 849条Unigene中,出现频率为28.29%,平均分布距离为2.51 kb。优势重复基序为三核苷酸、四核苷酸,分别占总SSR位点的50.16%和20.94%。ATG/ATG和AAAC/GTTT分别是三核苷酸、四核苷酸的优势重复基元,占总SSR重复类型的13.82%和3.66%。随机选取不同主导重复基元类型并合成SSR引物36对,以20份万寿菊自交系的基因组DNA为模板,对引物有效性和多态性进行了验证,30对引物可以扩增到清晰稳定的目标条带,有效扩增率为80.56%;其中13对引物具有多态性,平均He和PIC分别为0.275和0.608。以上结果表明,万寿菊转录组测序产生的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,获得的大批量SSR标记可为万寿菊的遗传多样性分析和遗传图谱构建提供可靠的标记选择。     

杜梨叶绿体基因组分析

利用高通量测序平台对杜梨(Pyrus betulaefolia)进行测序,并对其叶绿体全基因组序列的结构特征进行分析。结果表明,杜梨叶绿体基因组与大多数高等植物一样,具有典型的环状双链四分体结构。其叶绿体基因组大小为160 058 bp,共检测到61个SSR位点(58个单核苷酸重复和3个二核苷酸重复)和56个RNA编辑位点,这些RNA编辑位点均引起了氨基酸的变化。与砂梨(Pyruspyrifolia)、川梨(Pyrus pashia)和桃叶梨(Pyrus spinosa)的叶绿体基因组比较,其基因种类和数量都比较保守,表明了梨属植物进化的缓慢性。在4个梨属植物中共检测到351个SNP和217个InDel。     

白菜类作物氮利用效率的关联分析

为了研究白菜类作物氮利用效率遗传机制,定位与氮利用效率紧密相关的标记位点,利用分布于白菜全基因组的207个InDel标记,对160份有代表性的白菜类作物自然群体的基因组变异进行扫描,采用混合模型分析该群体的遗传结构,并应用TASSEL软件的GLM（General Linear Model）程序对叶片形态、植株形态和生物量相关的10个性状分别在两个氮处理水平进行关联分析。结果表明：InDel数据遗传结构分析将160个单株分为5个亚群体。关联分析结果表明：云南和北京的试验分别检测出45个和35个显著性相关标记,其中4个标记为两年共定位,平均贡献率为0.06。值得注意的是,关联到86个显著性变异位点只在一个氮水平被检测到,可能是氮处理水平的变化影响了某些相关基因的表达调控。