南瓜蚜传黄化病毒湖北和云南分离物的部分序列分析

 本研究从带有黄化症状的南瓜叶片中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增得到来自湖北和云南的南瓜蚜传黄化病毒(CABYV)2个分离物的1375nt特异性核苷酸片段。分别将PCR产物插入到克隆载体pMD19-T并转化大肠杆菌DH5α,对筛选到的阳性克隆进行了序列测定和分析(GenBank登录号为EF488996和EF488997)。所获片段含有部分复制酶基因576nt,非编码区199nt和完整的CP基因600nt,编码一个由199个氨基酸组成的分子量约为22kDa的结构蛋白。湖北和云南分离物与法国分离物、意大利分离物、西班牙分离物、北京分离物和上海分离物的CP基因核苷酸序列和推测氨基酸序列的同源性分别为93.1%~98.5%和91.4%~98.5%。     

黄瓜花叶病毒两个甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆

为明确黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）甜瓜分离物的分子变异情况及其侵染性,对2个甜瓜分离物CH99和XH18的基因组进行克隆、测序和分析,并通过构建全长cDNA克隆分析其侵染性。结果显示,黄瓜花叶病毒甜瓜CH99分离物3条RNA长度分别为3 356、3 049和2 211 nt,甜瓜XH18分离物3条RNA长度分别为3 381、3 048和2 217 nt。分离物CH99与XH18的核苷酸序列一致性为89.40%～95.80%,氨基酸序列一致性为90.00%～97.80%,CH99分离物与其他CMV分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性平均值分别为79.23%～89.29%和73.52%～93.90%,XH18分离物与其他CMV分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性平均值分别为79.81%～89.83%和74.02%～95.14%。遗传发育分析显示,这2个分离物均属于亚组IB成员。接种试验结果显示,分离物CH99和XH18的侵染性克隆构建成功,这2个分离物均能系统侵染本生烟、甜瓜和黄瓜,并在本生烟和甜瓜上引起较严重的症状,在黄瓜上引起的症状较弱,而二者均不能侵染西...     

番茄黄化曲叶病毒北京分离物侵染性克隆的构建与其致病性

为明确番茄黄化曲叶病毒北京分离物（Beijing isolate of tomato yellow leaf curl virus,TYLCV-BJ）致病性的强弱,以感染TYLCV-BJ的番茄叶片DNA为模板PCR扩增获得该分离物基因组全长序列,并构建该分离物的侵染性克隆,将其分别接种到番茄、烟草和拟南芥植株上,比较该分离物和TYLCV上海分离物2(TYLCV-Shanghai 2,TYLCV-SH2)致病性的差异。结果显示,该分离物基因组全长序列同TYLCV-SH2的相似度为99.03%,在番茄和烟草植株上TYLCV-BJ比TYLCV-SH2发病更早,症状更重,TYLCV DNA和外壳蛋白积累量更高。TYLCV-BJ可以通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens注射法在拟南芥中复制和系统侵染,而TYLCV-SH2不能有效侵染拟南芥。表明TYLCV-BJ的致病性强于TYLCV-SH2,所建立的侵染性克隆有广泛的研究和应用价值。     

北京地区辣椒上黄瓜花叶病毒和甜菜西方黄化病毒复合侵染的分子鉴定

辣椒是我国重要的蔬菜和经济作物,受多种病毒危害。2014年在北京市顺义区调查时发现部分种植的辣椒植株上叶片大面积黄化,边缘症状明显,个别植株叶片轻微上卷。提取典型症状样品的总RNA,反转录得到cDNA,分别用黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)特异引物和马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)通用引物进行PCR检测,CMV特异引物和马铃薯卷叶病毒属通用引物分别扩增得到约650bp和1 400bp的特异条带。测序和核苷酸序列比对表明,其分别与CMV和甜菜西方黄化病毒(Beet western yellows virus,BWYV)序列同源性最高为99%和96%。这是对我国种植的辣椒上发生的CMV和BWYV复合侵染的首次报道。     

草莓镶脉病毒侵染性克隆的构建

 利用草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)全长克隆pSVBV-E3构建SVBV侵染性克隆。pSVBV-E3经限制性内切酶酶切分别获得0.5-mer SVBV和1.0-mer SVBV,依次正向插入植物表达载体pBINPLUS,成功构建侵染性克隆重组质粒pBIN-1.5SVBV。pBIN-1.5SVBV转化农杆菌,分别接种森林草莓(Fragaria vesca)和4种烟草属植物(Nico-tiana spp.)验证其侵染性。结果表明,SVBV侵染性克隆接种森林草莓8周后发病,表现出典型的叶脉镶边黄化症状,PCR法可以从显症森林草莓中检测出SVBV cp基因,Southern blot法可以检测出SVBV基因组。而接种4种烟草属植物8周后未观察到发病症状,PCR法也未检测出SVBV cp基因。构建的SVBV侵染性克隆经接种验证能够侵染森林草莓,为进一步研究SVBV侵染森林草莓的致病机制奠定了基础。     

进口甜瓜种子中的南瓜花叶病毒的分离鉴定

本实验将美国进口甜瓜种子及用该种子在内蒙制种田繁殖的甜瓜种子播种后出现典型症状的病苗，进行生物接种和蚜传实验。该病毒只侵染葫芦科寄主，不蚜传。经电镜和免疫电镜观察，血清学检测和病毒外壳蛋白分子量测定，表明病毒粒体形态和外壳蛋白亚基诺带与南瓜叶病毒基本一致，血清学反应结果为阳性，实验证明两种甜瓜种子均带有种传的南瓜花叶病毒，种子带病毒率为１％～３．２％。     

携带eGFP的ZYMV侵染性克隆的构建及其侵染性

 小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)是瓜类作物主要病毒之一,严重威胁瓜类产业的可持续发展。本研究在ZYMV 甜瓜分离物CH-87侵染性克隆基础上,利用同源重组策略在NIb和CP编码序列之间插入了eGFP,命名为pXT1-ZYMV-eGFP。将pXT1-ZYMV-eGFP转化农杆菌并接种西瓜和甜瓜,结果发现pXT1-ZYMV-eGFP可以系统侵染西瓜和甜瓜,引起典型的花叶症状,在紫外灯下发病植株呈现绿色荧光。经摩擦接种证实,该克隆接种后所产生的病毒子代可以稳定的传播繁殖。研究表明携带eGFP的ZYMV侵染性克隆成功构建,可用于该病毒致病性及病毒与寄主互作的相关研究。     

香石竹斑驳病毒云南分离物全基因组序列测定和侵染性克隆构建

香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)是危害香石竹的一种重要病毒,本研究通过构建农杆菌介导的CarMV侵染性克隆来进一步研究该病毒基因功能。首先获得CarMV云南分离物全长序列,与报道的上海分离物相似性达到94.78%;将CarMV全长cDNA基因序列构建到具有35S启动子的双元表达载体pCV-nGFP,通过农杆菌浸润到本氏烟中瞬时表达,本氏烟系统叶片RT-PCR能检测到CarMV。试验结果表明,本研究构建Car-MV侵染性克隆通过农杆菌介导可快速高效侵染植物,可以用于病毒基因功能研究;同时CarMV云南分离物全长序列测定结果表明其属于P164 K331组群。     

侵染扶桑和棉花的木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆构建及致病性测定

从广东广州扶桑和广西南宁棉花中分离得到木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)的2个分离物GD37和GX01,序列分析表明两分离物的基因组全序列同源性为99.4%,卫星分子序列同源性为99.2%。构建了GD37和GX01的侵染性克隆,农杆菌接种表明CLCuMV GD37能侵染本氏烟、心叶烟、三生烟、普通烟,GD37和GD37β共同接种产生叶片下卷、植株矮化等症状,但不能侵染棉花、番茄、矮牵牛;而分离自棉花的CLCuMV GX01能够侵染本氏烟,GX01和GX01β共同接种在本氏烟上产生叶片下卷皱缩等症状,但不能侵染棉花。Southern-blot结果表明在GD37单独侵染或与GD37β共同侵染的植株中均能检测到相应DNA分子的积累。     

The recombinant isolate of cucurbit aphid-borne yellows virus from Brazil is a polerovirus transmitted by whiteflies

The severe yellowing disease (amarelão) on melon plants is a serious problem in Brazil, although the causative agent remained unknown for a long time. Recently, recombinant isolates of cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV) were reported as the possible causative agents of this disease on melon plants. Although aphids are known to be the vectors of the common type of CABYV isolates, almost no aphid colony was observed in the major melon fields in Brazil with high incidence of the severe yellowing disease. In contrast, whiteflies are often abundant. Based on this observation, the hypothesis of the transmission of recombinant CABYV by whiteflies was evaluated. After thorough transmission experiments, we found that this recombinant CABYV isolate was transmitted by the whitefly Bemisia tabaci MEAM1, but not by Aphis gossipii. Furthermore, the host response by whitefly-based inoculation in cucurbits and other indicator plants showed differences in host range when compared to the common type of CABYV. Due to its transmissibility by the whitefly and the distant relationship of the P3/P5 protein to CABYV, the name “cucurbit whitefly-borne yellows virus” is proposed for this recombinant CABYV. This is the second report of polerovirus transmission by the whitefly B. tabaci, following the report of pepper whitefly-borne vein yellows virus.     

携带GFP的MNSV侵染性克隆载体的构建

正甜瓜坏死斑点病毒(Melon necrotic spot virus,MSNV)属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)香石竹斑驳病毒属(Carmovirus),其主要寄主是葫芦科作物。MNSV首次在我国江苏海门发生[1],随后在山东寿光[2]、青州市[3]及广西南宁[4]等地均有报道。种子带毒是该病害初侵染的主要来源[5],随着种子调运、设施栽培推广和甜瓜产业的发展,该病害日趋严重。MNSV侵染初期叶片、叶柄和茎杆出现坏死斑或     

携带GFP的MNSV侵染性克隆载体的构建

Melon necrotic spot virus (MNSV) is a newly reported melon-infecting virus species in China, which is seriously terrible in melon production. The MNSV full-length cDNA of MNSV was obtained by RT-PCR and was ligated to pXT1 vector to obtain the infectious clone vector pXT1-MNSV. The melon was inoculated with pXT1-MNSV, and melon leaves infected with pXT1-MNSV were collected and inoculated into the healthy melon by sap. The results showed that the infectious clone pXT1-MNSV was well pathogenic and could be transmitted by sap, so the Koch′s law was completed. Using MNSV infectious clone, the MNSV infectious clone vector pMNSV-cp-GFP harboring full-length GFP was constructed, Because GFP fluorescence can be detected by RT-PCR and in both melon roots and leaves by confocal scanning laser microscopy. Here, We constructed MNSV infections clone and pMNSV-cp-GFP clone vectors for the first time in China. The MNSV infections clone provided a tool for the analysis of its pathogenic mechanism at the molecular level. In addition, we also constructed MNSV infectious clone vectors carrying GFP, which could be used in the fluorescent labeling of MNSV and its distribution, movement and colonization during virus infection.     

瓜类褪绿黄化病毒山东分离物全基因组序列扩增及分析

为明确分离自山东省寿光市甜瓜上的瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)分离物的全基因组序列信息和遗传变异情况,利用毛形病毒属Crinivirus简并引物进行RTPCR检测,利用RACE技术结合RT-PCR方法克隆CCYV山东分离物2条RNA链的全基因组序列,通过与GenBank中其它地区CCYV分离物的全长序列进行比对分析其同源性,并基于CP基因序列构建系统进化树分析其遗传变异情况。结果表明,山东分离物经RT-PCR检测和测序后确定为CCYV。CCYV山东分离物与其它CCYV分离物的RNA1链和RNA2链的全基因组序列一致性的平均值分别为99.82%和99.88%,且2条链的5′末端均比较保守,没有碱基突变的情况发生;RNA1链3′末端存在2个碱基变异,RNA2链3′末端存在1个碱基变异。CCYV不同地区分离物主要分为3个簇群,其中山东分离物和中国其它地区分离物、日本分离物、苏丹分离物、黎巴嫩分离物和塞浦路斯分离物聚类在一起。研究表明CCYV基因组序列比较保守,该病毒的分化可能与地理来源存在一定的相关性。     

瓜类褪绿黄化病毒自然侵染南瓜及分子进化分析

瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)可侵染多种瓜类,主要危害叶片,影响其光合作用,导致减产.采集湖南省南瓜疑似病毒病样品经siRNA测序发现CCYV,进一步RT-PCR验证CCYV可自然侵染南瓜,检出率为5.78％,这是我国内地首次发现CCYV可自然侵染南瓜.持...     

瓜类褪绿黄化病毒外壳蛋白的亚细胞定位及致病作用浅析

瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)是近些年来出现的一种烟粉虱 Bemisia tabaci传播的植物病毒,在瓜类生产中造成了严重损失。为了解该病毒外壳蛋白(coat protein, CP)在病毒侵染寄主过程中的亚细胞定位和致病作用,本研究以CCYV山东黄瓜分离物为研究对象,构建了荧光表达载体CP-YFP和异源表达载体pGR-CP。浸润荧光表达载体48 h后的本氏烟Nicotiana benthamiana叶片在激光共聚焦显微镜下可以观察到荧光信号在细胞质和细胞核内均有分布;浸润异源表达载体的本氏烟植株7 d后上部叶片开始显现花叶症状,13 d后顶部新叶出现严重皱缩和坏死斑点。以上结果表明CCYV CP蛋白参与了病毒对寄主的侵染过程,可能是症状形成的致病相关因子。本研究为进一步解析该病毒的致病机理提供了初步的理论支持。