杂柑‘W·默科特’黄龙病菌分子鉴定和遗传多样性分析

2017年12月在云南红河新引种的‘W·默科特’杂柑植株上发现疑似黄龙病的叶片斑驳及"红鼻子果"症状。采集疑似的叶片和果实,分别提取其叶片中脉和橘络的DNA,利用黄龙病菌的特异引物对其16S rRNA基因和β–操纵子基因进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序分析。研究结果表明,采自云南的‘W·默科特’样品中PCR能够扩增出黄龙病菌的特异条带,通过上述基因进行系统发育分析,发现该病菌归属于黄龙病菌亚洲种;为了进一步探明这些黄龙病菌的遗传多样性,利用3种类型的原噬菌体特异性引物对样品进行扩增分析,结果表明采自云南的‘W·默科特’植株上的黄龙病菌遗传多样性较为丰富。     

云南普文葡萄柚黄龙病病原分子检测及鉴定

为确定云南林科院普文林场葡萄柚试验园从美国佛罗里达州引种的葡萄柚品种是否感染黄龙病以及其病原类型,采集116个柑桔黄龙病疑似病样进行PCR检测、16SrDNA序列测定及系统进化分析。结果表明,116个样品中共有96个样品感染黄龙病,总感病率达到82.8%;在该试验园分离出的黄龙病菌16SrDNA的序列一致性达到100%,与NCBI中的柑桔黄龙病亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)、柑桔黄龙病非洲种(Candidatus Liberibacter africanus)和柑桔黄龙病美洲种(Candidatus Liberibacter americanus)序列的相似性分别为100%、97.6%~98.5%和96.0%~96.7%。该试验园葡萄柚上的柑桔黄龙病菌属于亚洲种。     

江西省吉水县柑桔黄龙病菌检测

为了确切诊断江西省吉安市吉水县近年出现的疑似柑桔黄龙病,2019年12月从该县6个柑桔园中共采集12份(株)叶片样品,采用PCR和序列测定技术对叶样进行黄龙病菌检测.结果,从6份样品中检测到柑桔黄龙病菌亚洲种,即亚洲韧皮部杆菌(CandidatusLiberibacter asiati-cus,CLas).表明吉水县已...     

江西抚州南丰蜜桔黄龙病菌的检测与分子鉴定

2015年10月抚州地区南丰县和广昌县的南丰蜜桔植株出现了类似黄龙病的症状。为探明抚州地区南丰蜜桔是否携带黄龙病菌,从南丰县和广昌县采集疑似感染黄龙病的南丰蜜桔叶片,利用黄龙病菌的特异引物对其16SrDNA和β-操纵子基因进行PCR扩增,并利用生物信息学的方法对扩增产物进行同源性分析。结果表明,来自南丰县和广昌县的样品均检测到黄龙病菌,该病菌属于亚洲种。这是在江西抚州地区的南丰蜜桔上首次检测到黄龙病菌。     

贵州柑桔主产区柑桔黄龙病菌发生及遗传多样性研究

为掌握贵州省柑桔黄龙病的疫情及了解病原菌的遗传多样性,2015—2016年在15个县(市)采集了104份柑桔黄龙病疑似样品,进行柑桔黄龙病菌16SrDNA常规PCR检测及柑桔黄龙病菌亚洲种噬菌体转移酶基因位点多态性分析。结果表明,供试样品有19份检测为阳性,阳性检出率为18.27%。贵州柑桔黄龙病疫情主要集中在罗甸、望谟、兴义、册亨等黔南和黔西南柑桔黄龙病发生老区,从江、榕江等黔东南地区疫情得到一定控制,遵义及铜仁等地区未发现疫情。贵州省内柑桔黄龙病菌有丰富的遗传多态性,在地理来源及寄主品种来源上均表现出遗传差异。     

柑桔黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测

为了建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)快速检测体系,丰富柑桔黄龙病的高效简便检测方法,以黄龙病菌株psy62全基因组中的单拷贝tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因簇序列和5拷贝核糖核苷酸还原酶β亚基基因(nrdB)序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系,并经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑桔样品的黄龙病菌进行对比检测,验证RPA检测体系的适用性。结果表明,建立的黄龙病菌RPA检测方法能特异性检测柑桔黄龙病;灵敏度与实时荧光PCR相当,是PCR的100倍;扩增过程只需20 min,大幅提高检测效率;对田间疑似柑桔黄龙病的送检样品检测结果与实时荧光PCR一致,比PCR的检出率高。     

应用DTBIA技术快速检测柑橘黄龙病菌研究

柑橘黄龙病病原菌为韧皮部限制性寄生菌Candidatus Liberibacter,迄今为止尚未成功获得离体纯培养。因此基于特异性抗体的高通量血清学检测技术迄今尚未开发。本实验室前期研究利用异源表达重组黄龙病菌外膜蛋白Omp_(CLas)免疫动物,制备并获得了特异性多克隆抗体(Anti-Omp_(CLas)-Pab)。本研究利用直接组织印迹免疫法(Direct tissue blot immunoassay,DTBIA)技术对获得的多克隆抗体的检测效果进行了初步评价,证实该抗体可以特异性识别中国不同地理来源的柑橘黄龙病菌分离物;柑橘叶柄、叶片中脉、枝条、根部、果梗和种子中均存在黄龙病菌,其中根部和种子中的病菌含量相对较低,枝条和叶片中脉中的含量较高。该多克隆抗体的获得为后续快速检测试剂盒或试纸条的研发奠定了基础。     

柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。     

柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立

根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。     

广西桂南山黄皮中柑橘黄龙病菌常规PCR检测初报

为了明确山黄皮是否是黄龙病菌的天然寄主，以广西南宁和龙州县部分柑橘黄龙病发生区的山黄皮为调查对象，采集其叶片，利用常规PCR检测方法检测黄龙病菌的侵染情况。结果显示所有山黄皮材料均未检测出黄龙病菌。     

柑橘中黄龙病菌效应子SDE70的表达特征及寄主互作蛋白解析

柑橘黄龙病菌主要致病种亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,Las）具有完整的Sec依赖型分泌系统,可分泌致病因子（效应子）作用于寄主靶标蛋白或基因,调控寄主的抗（感）病反应。为了研究黄龙病菌Sec依赖型效应子在柑橘中的致病机理及其寄主靶标基因,本研究中从感病‘锦橙’中克隆了Las病原菌Sec依赖型效应子基因SDE70（CLIBASIA_02470）。生物信息分析显示,SDE70蛋白全长132个氨基酸,N端20个氨基酸为典型信号肽。大肠杆菌碱性磷酸酶活性分析显示,该信号肽具有胞外分泌功能。亚细胞定位显示,SDE70::GFP融合蛋白在洋葱细胞质和细胞核中积累。定量PCR分析发现,耐黄龙病酸柚显症叶脉中SDE70表达量显著低于未显症叶脉,相反,易感黄龙病‘锦橙’显症叶脉中表达显著高于未显症叶脉;‘锦橙’根中SDE70表达量显著高于叶脉,而幼叶叶脉中显著低于老叶。SDE70在不同品种不同症状发育时期以及不同组织中表达差异显著。利用酵母双杂交试验筛选获得26个与SDE70互作的柑橘蛋白。GO富集分析表明,42.3%的蛋白质与细胞内生物合成过程有关;65.4%的靶标蛋白位于细胞质或质膜上;34.6%的靶标蛋白具有核糖核苷酸结合的分子功能。进一步酵母点对点杂交试验验证3个与SDE70效应子强相互作用的靶标蛋白（CsTRAPP、CsARF、CsRub1）,其主要参与植物囊泡转运、类泛素化等过程,暗示SDE70效应子极有可能调控柑橘信号转导和胞质运输途径影响寄主抗（感）病反应。     

柑橘愈伤组织RNAi沉默CCD1基因对其类胡萝卜素积累的影响

类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD）可催化类胡萝卜素在特定位点氧化裂解生成多种生物活性化合物，其活性差异一定程度上决定了植物体内类胡萝卜素含量和组成变化。为了探讨柑橘中CCD1蛋白对类胡萝卜素积累的影响，从红肉脐橙（Citrus sinensis L. Osbeck）果实中克隆了CCD1 基因，将其特异片段通过重组反应连接到pHGRV 载体中，构建CCD1 的RNA 干扰载体pHGRV-CCD1。利用农杆菌介导的方法将其转入‘国庆1 号’蜜柑、‘伏令夏橙’和‘马叙’葡萄柚愈伤组织中，经PCR 鉴定分别获得6、4、4 个转基因干扰系。3 种柑橘材料转基因干扰系中CCD1 基因的表达水平均较野生型显著下调，其中‘马叙’葡萄柚转基因干扰系Rm2 的表达水平仅为野生型的8.4%，干扰效果最佳。CCD1 转基因干扰系愈伤组织外观多数呈现与野生型对照相近的色泽，仅Rm2 系可见较为明显的颜色变化；综合分析3种柑橘材料转基因前后类胡萝卜素含量变化，发现CCD1 基因抑制表达后，紫黄质、9–顺式–紫黄质的含量均较野生型显著增加，表明其可能是CCD1 在柑橘愈伤组织体内优先选择的裂解底物。     

脐橙品种‘赣南早’与‘纽荷尔’对柑橘溃疡病的抗性比较

【目的】比较分析‘赣南早’与其芽变前的‘纽荷尔’品种叶片气孔及表皮形态特征、叶片解剖结构及对柑橘溃疡病的抗病性,为生产中合理布局早晚熟脐橙品种,推广‘赣南早’品种提供科学依据。【方法】通过离体叶片针刺接种检测‘赣南早’与‘纽荷尔’品种对柑橘溃疡病的抗性反应、电镜扫描及石蜡切片等技术观测2个品种叶片解剖结构,测定2个品种接种溃疡病菌后植株体内5种与抗性相关防御酶活性的变化,分析柑橘溃疡病菌对2个品种的诱导抗性。【结果】接种试验表明侵染‘纽荷尔’品种感病所需的柑橘溃疡病菌最低浓度为1.0×106CFU·m L-1,小于‘赣南早’所需最低浓度1.0×107CFU·m L-1,溃疡病菌在‘纽荷尔’品种上比在‘赣南早’品种上易于扩展和形成病斑;两个品种在气孔密度、叶片厚度、栅栏组织和海绵排列紧密度上均存在差异,酶活性测定表明接种溃疡病菌后2个品种体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等相关防御酶活性均有不同程度的提升,但2个品种间相关酶活性变化程度差异不显著。【结论】通过对‘赣南早’和‘纽荷尔’2个品种抗病性测定及叶片解剖结构特征发现‘赣南早’品种对柑橘溃疡病的抗性强于其芽变前的‘纽荷尔’品种。     

赣南柑桔黄龙病菌16S rDNA、16S/23S rDNA间隔区和核糖体蛋白基因的遗传多样性

为探究赣南地区柑桔黄龙病菌的遗传多样性,从赣南16个县(市、区)采集32份具典型柑桔黄龙病症状的脐橙叶片样品,运用PCR-RFLP(聚合酶链式反应-限制性长度多态性分析)技术研究柑桔黄龙病菌16SrDNA序列、16S/23SrDNA间隔区序列和核糖体蛋白基因的多态性,并对3个基因片段进行测序,分析序列的碱基含量、碱基转换率与颠换率、相似性、核苷酸遗传距离和系统进化特征。结果表明,供试赣南柑桔黄龙病菌样品在3个基因片段上的RFLP指纹图谱均一致,未表现出多态性,且序列相似性均在98%~100%;序列碱基中的GC含量以16SrDNA最大,序列碱基的转换率/颠换率以16SrDNA最小;赣南柑桔黄龙病菌样品与亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus之间的序列相似性最大、核苷酸遗传距离最小,在系统进化中归属亚洲种。     

柑橘黄龙病菌原噬菌体的遗传多样性分析

以采自广东、广西、海南、云南、四川、贵州等6个地区共300份感染柑橘黄龙病菌的DNA样本作为试验材料,通过PCR技术对黄龙病菌携带的3种类型原噬菌体基因进行特异扩增、测序,利用相关生物信息学软件进行遗传多样性分析。结果共鉴定出8种原噬菌体组合;携带单一原噬菌体类型的黄龙病菌株为6个地理种群的优势菌株,占比53.3%,其中以Type 2型为主;3类原噬菌体基因位点中A+T含量均高于G+C,表现出AT偏好特点;重组分析结果显示黄龙病菌间无重组信号,表明未发生重组事件;基因流N_m值均大于1,说明黄龙病菌在各种群中基因交流频繁;中性检验结果显示Tajima’s D、Fu and Li’s D、Fu and Li’s F值均小于0,表明黄龙病菌种群存在过历史扩张。     

中国柑橘黄龙病菌16S rDNA序列研究

 运用PCR技术对来自中国7省区不同寄主上的黄龙病菌16S rDNA基因区进行了PCR-RFLP-SSCP分析, 采用3种限制性内切酶进行单酶切、双酶切及三酶切反应,对酶切产物进行了单链构象多态性（SSCP）分析,结果表明来自7省区不同寄主上9个黄龙病病菌分离物的16S rDNA无可见变异;同时对9个代表性的分离物16S rDNA进行了克隆测序,序列多重比对结果与PCR-RFLP-SSCP一致,从而在分子水平上证明了中国柑橘黄龙病病菌的16S rDNA序列高度保守, 在不同的地域、寄主内没有发现分子变异,为进一步研究柑橘黄龙病菌系统进化奠定了基础。     

柑橘黄化脉明病毒DTBIA检测方法的建立

通过柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）兔源多克隆抗体（一抗）及Ap标记羊抗兔IgG（二抗）最佳稀释度等条件优化建立了CYVCV直接组织点免疫（Direct tissue blot immunoassay,DTBIA）检测方法,并对其特异性、稳定性和检测效果进行了评价。试验结果显示,一抗、二抗稀释比例分别为1︰8 000和1︰2 000时,DTBIA检测CYVCV效果最佳;应用所建立的DTBIA方法对携带9种不同柑橘病害的柑橘样品进行检测时,仅携带CYVCV样品呈阳性反应;柑橘黄脉病样品植物组织印迹后,印迹膜于4 ℃保存,90 d内可进行有效的CYVCV检测;对田间不同柑橘品种利用DTBIA法检测CYVCV,其结果与一步法RT-PCR符合率为97.92%。可见,该CYVCV检测方法快速、简便、稳定、特异及可靠,可推广应用于田间快速检测CYVCV,对于防范柑橘黄化脉明病毒大面积传播流行具有重要的现实意义。     

柑橘黄龙病菌在寄主体内含量动态变化研究

【目的】探索柑橘黄龙病流行规律,可以为果园柑橘管理提供指导,对延长柑橘黄龙病树的经济寿命具有重要意义。【方法】利用TaqMan qPCR荧光定量检测技术,从2017年8月至2018年10月监测江西赣州柑橘果园中黄龙病病原物的时间动态变化,结合气候数据分析柑橘黄龙病病原物与气候之间的相关性。【结果】柑橘黄龙病亚洲种含量年动态变化中,2017年8—11月和2018年5—7月有2个高峰,2018年4—5月和2018年7—8月会有2个低谷,整体呈现树冠北面枝条病菌含量高于南面,且症状严重程度与病菌含量呈反比。气候数据分析柑橘黄龙病菌含量与月下雨天数和月平均最高气温无相关性。【结论】果园中柑橘黄龙病亚洲种含量变化呈现一定规律消涨趋势,与以往的研究结果有相同之处,在10月存在高峰;柑橘体内亚洲种含量变化与温度和下雨天数这2个气候因子无相关性。     

花粉传播黄龙病可能性研究

为明确柑橘黄龙病能否通过授粉途径进行传播,研究采集了黄龙病发病沙田柚的花粉,将其授到6株健康温州蜜柑树的花上,定期观察被授粉树症状,并通过实时荧光定量PCR方法检测是否感染黄龙病菌.结果表明,授粉后30 d、60 d、90 d和180 d,被授粉树均生长正常,未出现黄龙病症状,也未从授粉树上检测出黄龙病菌.说明花粉传播...     

枳属砧木对柑橘黄龙病的抗性评价

柑橘砧木影响着柑橘品种多种园艺学与病理学性状,选育优良砧木是柑橘优质丰产的基础。本研究以13个枳属及其杂交种砧木为研究对象,分别嫁接黄龙病接穗后,通过观察症状表现及黄龙病菌浓度检测评估供试砧木对黄龙病的抗性。结果表明供试的砧木品种嫁接病穗3个月后除LT54、LT52、飞龙枳和枳柚外上均表现出了黄龙病症状,嫁接6个月后所有供试砧木品种均表现出黄龙病症状。黄龙病菌浓度检测结果显示,嫁接3个月后除了8株砧木外结果均为阳性,嫁接后6个月所有砧木检测结果均为阳性,供试接穗嫁接前和嫁接6个月后的病菌平均浓度相当。本研究结果表明供试的砧木品种均不抗黄龙病,为抗柑橘黄龙病砧木的进一步筛选奠定了良好基础。