鸡免疫球蛋白AFc(IgAFc)重链的分离纯化及其抗血清的制备

经硫酸铰盐析、柱色谱分离得到纯化的鸡胆汁免疫球蛋白A(IgA)。然后用木瓜蛋白酶水解IgA,再经DEAE_(52)—纤维素柱色谱纯化得到IgAFc重链。用IgAFc重链免疫家兔制得兔抗鸡IgAFc重链抗血清。     

双峰驼TLR2多克隆抗体的制备及其在免疫组化检测中的应用

为了制备兔抗双峰驼Toll样受体2(TLR2)的多克隆抗体并鉴定其活性,试验选择双峰驼TLR2基因序列,选取编码区,经软件分析预测该区域编码蛋白的主要氨基酸抗原位,选择对应的核苷酸序列进行基因合成,构建双峰驼TLR2重组质粒(pET28a-TLR2);通过原核表达系统诱导pET28a-TLR2表达,并优化异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)表达条件;表达的蛋白溶解变性后,与Ni-NTA镍柱填料结合,经亲和层析法纯化,用纯化后的蛋白免疫新西兰白兔并制备多克隆抗体;利用SDS-PAGE鉴定蛋白表达和纯化情况,间接ELISA试验、Western blot检测及免疫组化验证并评价多克隆抗体的效价与反应性。结果表明：成功表达双峰驼TLR2重组蛋白,大小约为64 kDa,最佳诱导表达条件：IPTG浓度为0.4 mol/L、诱导时间为5 h,蛋白质以包涵体的形式表达;抗体效价为1∶256 000,能特异性识别目的蛋白;在双峰驼十二指肠肠系膜淋巴结和脾脏中,抗体能特异性识别双峰驼TLR2阳性细胞,细胞类型以单核/巨噬细胞为主,具有良好的特异反应性。说明成功制备的兔抗双峰驼TLR2多克隆抗体具有良好...     

A型口蹄疫病毒抗原表位与牛IgG重链恒定区的融合表达及活性鉴定

为了研制广谱高效的A型口蹄疫新型多表位疫苗,根据GenBank数据库的A型代表毒株VP1序列设计并合成了VP1结构蛋白上的主要抗原表位DNA段,即135 aa～160 aa和200 aa～213 aa,与牛IgG重链恒定区编码基因连接,将合成的2个表位基因经Xho工、EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后依次克隆到pET-30a(+)载体上,构建重组质粒pRE2IgG,将其转化到大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达融合蛋白pRE2IgG,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,Western blot检测.结果显示,重组蛋白获得高效表达,并以包涵体形式存在,其分子质量约为60 ku,且能与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性.     

猪瘟疫苗免疫猪群中抗体水平的检测

应用ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ技术对猪瘟疫苗免疫猪群中的血清抗体水平进行了检测。共检测４个县的猪血样４８６份,检出血清抗体阳性４４９份,阳性率为９２．３９％,群体免疫保护率在８４．２４％～９４．２５％之间,群体均分值在８９．５～９８之间。     

免疫小鼠血清中猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒的研究

为研制一种小鼠血清中猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）抗体检测试剂盒,以PCV2 Cap蛋白兔多抗作为包被用抗体,捕获纯化的PCV2 Cap蛋白,制备抗原检测板,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG作为二抗,建立检测小鼠血清中PCV2抗体ELISA检测方法并制备试剂盒。采用所制备的ELISA试剂盒对50份已知阴性血清样本进行检测,临界OD450nm值为0335;采用ELISA试剂盒与IFA分别对100份血清检测,总符合率为96%,检测小鼠血清敏感性效价达1∶16000,与其他常见的猪病毒小鼠阳性血清无交叉反应,2～8 ℃保存15个月稳定,批内变异系数为2.28%～4.17%,批间变异系数为4.27%～6.02%,具有良好的敏感性、特异性、稳定性及重复性;采用ELISA试剂盒对不同来源疫苗免疫组小鼠血清进行检测,均显示良好效果。研究表明,本研究制备的ELISA试剂盒可用于小鼠血清中PCV2抗体效价检测。     

牛奶中AFM1人工抗原的合成及多克隆抗体血清的制备

本研究合成并鉴定了黄曲霉毒素M1人工抗原,通过动物免疫制备出敏感性高、特异性好的鼠源黄曲霉毒素M1多克隆抗血清。采用琥珀酸酐改造黄曲霉毒素M1,并将其改造物按两种方法(DCC和EDC)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,合成免疫抗原AFM1-BSA和检测抗原AFM1-OVA,经过薄层色谱、紫外扫描和凝胶电泳鉴定后,免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔3周,最后1次免疫10d后,断尾采血,制备多抗血清。经过测定,免疫的3只小鼠效价均达到了1:104以上,2号小鼠多抗血清的敏感性最好,半数抑制浓度IC50(50%inhibitive concentration,IC50)为37.61ng/m L,且具有良好的特异性。本研究成功合成了黄曲霉毒素M1人工抗原和多克隆抗体血清,为黄曲霉毒素M1单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

采用全菌抗原干燥包被法ELISA检测禽霍乱血清抗体的研究

利用戊二醛的偶联作用将禽多杀性巴氏杆菌的全细胞抗原在聚苯乙烯酶标板上进行干燥包被,酶标板以2.5%的戊二醛溶液预处理.通过直接和间接ELISA方阵滴定确定其包被的全菌抗原最适浓度为108个菌/mL.特异性、重复性、稳定性检验,以及初步建立的间接ELISA用于样品检测的结果表明,所创建的禽多杀性巴氏杆菌全菌抗原干燥包被方法能够很好地应用于建立检测禽霍乱血清抗体的ELISA.     

可溶性E2蛋白作为抗原的检测猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法的建立

以可溶性重组E2蛋白作为抗原,建立了猪瘟病毒(CSFV)血清抗体间接ELISA诊断方法(rE2-ELISA).将猪瘟疫苗毒株E2基因主要抗原区(A-D)基因克隆到表达栽体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至20℃,获得48 000大小E2融合蛋白,部分目的蛋白以可溶性形式表达.Western blotting试验证实,E2融合蛋白可以和CSFV阳性血清发生特异性结合.亲和层析纯化后的E2融合蛋白作为抗原,建立了检测CSFV血清抗体的间接rE2-ELISA方法.该方法的特异性试验结果表明,与PRRSV、PCV2、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rE2-ELISA和国外同类试剂盒(CSF-Ab-Kit)检测142份田问血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为83.81%和88.73%.因此,rE2-ELISA猪瘟抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合应用在大规模的CSFV血清抗体的检测工作中.     

口蹄疫O型灭活疫苗对不同母源抗体仔猪血清中抗体及细胞因子水平的影响

为了解不同母源抗体水平对仔猪免疫后抗体消长的影响,以及免疫后细胞因子的变化,使用口蹄疫O型灭活疫苗对40头初生仔猪进行免疫,并于初次免疫后28 d二次免疫,采用液相阻断ELISA方法检测血清中抗体滴度,双抗体夹心ELISA法检测血清IL-8和IL-12水平。结果显示,母源抗体水平越高对于初次免疫后仔猪抗体影响越大;二次免疫后抗体水平可长时间维持较高水平。初次免疫后14 d~28 d,血清中IL-8和IL-12水平上升极显著(P0.01);二次免疫后14~28 d,IL-8水平上升极显著(P0.01),IL-12水平上升不显著(P0.01)。试验表明,母源抗体水平是影响仔猪免疫后抗体消长的因素之一;口蹄疫O型灭活疫苗能有效提高血清中IL-8和IL-12水平。     

Study on the Change Rule of Egg Yolk Antibody in Laying Hens after First Immunization by Japanese Encephalitis Virus

The purpose of this experiment was to study the immunization rule of the egg yolk antibody affected by different vaccines,immunization dose and injection ways and further to discuss the optimal immunization procedures of the laying hens for the preparation of egg yolk antibody against swine Japanese encephalitis virus.180 brown laying hens without any vaccines were selected and divided into 18 groups randomly,each group of 10 hens.Groups 1,2 were the control groups,injected with the sterile saline;Groups 3 to 10 were injected with subcutaneous or intramuscular injection,and the vaccine was injected with 0.2,0.5,1.0 and 1.5 mL successively.Groups 11 to 18 were also adopted two kinds of injection,followed by the same dose of vaccine immunization.Six eggs of each experimental group were gathered before immune day and after 3,7,10,14,18,21 and 28 days,the egg yolk antibody was extracted and the titer was determined.As a result,the egg yolk antibody titers of groups 1 to 6,11 and 12 were all 0,and no significant immune response produced;The hens from 7 to 10 groups were injected with the inactivated vaccine.After 7 days,the average antibody titer reached the peak,and the duration of the antibody was 14 days.The hens from 13 to 18 groups were injected with the attenuated virus vaccine.After 14 days,the average antibody titer reached the highest value,and the duration of the antibody was 21 days.The egg yolk antibody titers were not significantly different in the two compared experiment groups with the same injection dose but with different injection ways (P>0.05).With the same injection way of each experiment group,and the difference was significant (P>0.05).Compared with some groups with the same injection and vaccine,the titer of yolk antibody was gradually increased with the increase of the immune dose,and the difference was significant (P<0.05).The results showed that,no matter intramuscular or subcutaneous injection,in order to produce a significant immune response to hens,the immune antigen dose was 1.0 mL inactivated vaccine or 0.5 mL attenuated vaccine at least.Compared with the attenuated and inactivated vaccine,inactivated vaccine stimulated the body to produce the antibody faster,but the maintenance time was shorter;The lower dose of attenuated vaccine could stimulate the body to produce antibodies,but the speed was slower,the maintenance time was longer.     

蛋鸡首免乙型脑炎病毒后卵黄抗体变化规律的研究

本试验旨在研究疫苗、免疫剂量和注射方式对卵黄抗体效价规律的影响,探讨制备抗猪乙型脑炎病毒卵黄抗体蛋鸡的最佳免疫程序。选用无免疫褐羽蛋鸡180只,随机分成18组,每组10只。1、2组均为对照组,注射无菌生理盐水;3~10组采用皮下和肌肉两种注射方式,并依次注射灭活苗0.2、0.5、1.0和1.5 mL;11~18组同样采取两种注射方式,依次免疫相同剂量弱毒苗。各试验组分别于免疫前1 d、免疫后第3、7、10、14、18、21和28天采集当日鸡蛋6枚,提取卵黄抗体,测定效价。试验结果显示,1~6、11、12组卵黄抗体效价均为0,未产生明显免疫应答;7~10组注射灭活苗后7 d,平均卵黄抗体效价达到峰值,抗体持续时间为14 d;13~18组注射弱毒苗后14 d达到最高值,抗体持续时间为21 d;注射剂量相同但注射方式不同的两组之间比较,卵黄抗体效价差异不显著（P>0.05）;相同注射方式,相同疫苗的各试验组间,随着免疫剂量的增加卵黄抗体效价逐渐加强,且差异显著（P<0.05）。以上结果表明,肌肉或皮下两种注射方式,蛋鸡产生明显免疫应答至少需要免疫灭活苗1.0 mL或弱毒苗0.5 mL。比较弱毒苗与灭活苗,灭活苗刺激机体产生的抗体速度较快,但维持时间较短;较少剂量弱毒苗就可刺激机体产生抗体,但速度慢、维持时间长。     

应用间接血凝试验检测水牛伊氏锥虫病抗体消长的研究

应用间接血凝试验对4头人工感染伊氏锥虫病水牛的抗体消长进行了检测,结果表明,抗体最早出现的时间为感染后3～6d,第9d达到高峰.高峰时抗体滴度为1:1280～5120.纳加诺尔治疗后,抗体滴度缓慢下降,但有波动,治疗后86～101d全部转阴.由此表明,间接血凝试验用于检测水牛伊氏锥虫病的抗体,具有早期诊断和疗效考核价值.     

集约化猪场不同毒株猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗免疫后血液中持续带毒及抗体消长规律研究

某地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与中国高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(hp-PRRSV)同源性极高,为了筛选适合该地区病情的疫苗,指导养殖户生产,试验选择hp-PRRS弱毒活疫苗(JXA1-R株)和PRRS弱毒活疫苗(VR-2332株)作为疫苗候选株,选取30日龄、健康状况良好、群体差异性小的断奶仔猪30头,随机分成A、B和C组,每组10头,A组注射hp-PRRS弱毒活疫苗(JXA1-R株),B组注射PRRS弱毒活疫苗(VR-2332株),C组注射相同剂量生理盐水作对照,免疫前和免疫后14、28、42、56、70、84 d采集血清,通过淋巴细胞计数、血清病毒核酸检测、血清抗体检测等分析猪体内hp-PRRS弱毒活疫苗(JXA1-R株)和PRRS弱毒活疫苗(VR-2332株)免疫应答情况.试验结果显示,淋巴细胞数量方面,仔猪免疫后,淋巴细胞数量均上升,42 d时A、B组均达到最大值,A组为19.3×10⁹/L,B组为16.7×10⁹/L,C组则一直处于原始水平;抗体阳性方面,14 d时A组为80%,B组为60%,C组为0,42 d时A组为100%,B组为80%,C组为0;病毒核酸阳性率方面,14 d时A组为90%,B组为100%,C组为0,42 d时,A组为40%,B组为70%,C组为0,70 d时,A组为0,B组为20%,C组为0.由此可知,hp-PRRS弱毒活疫苗(JXA1-R株)能快速诱导猪发生免疫应答、产生免疫抗体,抗体持续时间长、效价高、稳定性良好,且疫苗毒在体内存在时间短、减毒时间快、安全性高,对所研究地区猪群免疫具有优越效果.     

三江源区不同退化梯度高寒草原土壤重金属含量及其与养分和酶活性的变化特征

为了探讨不同退化梯度高寒草地土壤重金属含量对土壤养分和酶活性的影响,本试验以三江源区玛多县周边高寒草地未退化（Non-degraded grassland,ND）、轻度退化（Light degraded grassland,LD）、中度退化（Moderate degraded grassland,MD）以及重度退化（Heavy degraded grassland,HD）4种不同退化梯度为研究对象,分别采取高寒草地0~10 cm、10~20 cm和20~30 cm的土样,对土壤理化性质（全氮、全磷、全钾和全碳等）、酶活性（脲酶、蔗糖酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、磷酸酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶）和重金属含量（铜Cu、铬Cr、铅Pb、锌Zn和镉Cd）进行测定和分析。试验结果表明,土壤理化性质、酶活性和重金属含量随着高寒草地退化程度的加剧呈先降低后上升再降低的趋势。土壤理化性质中,不同退化程度草地0~10 cm土层土壤全碳、硝态氮和pH差异显著（P<0.05）;10~20 cm土层土壤全氮、硝态氮、全碳和pH差异显著（P<0.05）;20~30 cm土层土壤全氮和全碳差异显著（P<0.05）。土壤酶中,不同退化程度草地0~10 cm土层土壤脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶,差异显著（P<0.05）;10~20 cm和20~30 cm土层土壤脲酶、蔗糖酶、淀粉酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶差异显著（P<0.05）。土壤重金属元素含量中,不同退化程度草地0~10 cm和10~20 cm土层土壤Cu,Cd,Zn以及20~30 cm土层Cu,Cr,Cd差异显著（P<0.05）。同一退化程度随土层加深重金属含量具富集趋势。相关性分析显示5种重金属含量与土壤理化性质和土壤脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶以及过氧化氢酶显著相关（P<0.05）。根据土壤污染负荷指数法计算,各退化梯度土壤均属于重金属中度污染。综上所述,本试验分析了不同退化草地土壤物理变化、酶活性变化及重金属含量变化,可为三江源高寒草地土壤健康、资源可持续利用、防止土壤退化提供参考。