转基因棉花中新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

为了建立高灵敏度定量检测转基因棉花(Gossypium sp.)中新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)双抗体夹心酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),本研究以体外条件下制备NPTⅡ蛋白质为免疫原,制备兔(Lepus)抗NPTⅡ多克隆抗体为捕获抗体,小鼠(Mus musculus)抗NPTⅡ单克隆抗体为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法,以系列含量的NPTⅡ蛋白质作为标准品,建立标准曲线,对该方法各项指标进行验证,并对样品中所含NPTⅡ进行定量检测。结果表明,该双夹心ELISA对NPTⅡ检测范围为3.370~108.125 ng∕mL,最低检测限为1.97 ng/mL;准确性实验回收率为96.11%~104.69%;精密性变异系数为6.58%~7.33%;与非转基因棉花内源蛋白质及其他种类转基因蛋白质无交叉反应;应用此方法对苗期转基因棉植株各部位NPTⅡ表达量进行检测,发现有明显差异。该方法特异性强,灵敏度高,准确性、重复性和稳定性好,适用于检测转基因棉花中NPTⅡ含量,能够为今后转基因作物检测方法的建立及生物安全性评价等方面提供参考,具有良好应用价值和前景。     

小反刍兽疫N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种危害严重的急性接触性传染病。为了检测血清中存在的抗PPRV的抗体,本研究利用纯化后的真核表达的PPRVN蛋白重组蛋白(rBacmid-PPRN)作为免疫原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),并使用原核表达的PPRVN蛋白重组蛋白(rpET-PPRN)作为间接ELISA检测抗原,共筛选得到8株抗PPRVN蛋白的单克隆抗体(mAb)。其中1D5单抗腹水效价达1∶106,分泌单抗亚类为IgG2b。以1D5作为竞争抗体、纯化后的rpET-PPRN蛋白作为包被抗原,建立了检测小反刍兽疫血清抗体的单抗竞争性ELISA(c-ELISA)方法。所建立的c-ELISA方法能够特异性的区分牛瘟阳性血清和小反刍兽疫阳性血清,并具有较高的灵敏度和特异性。应用建立c-ELISA检测方法检测共129份山羊(Capra hircus)血清样品,与标准c-ELISA试剂盒的符合率为96.9%。本研究成功地建立了可特异性检测动物血清中抗PPRV抗体的竞争性ELISA方法,对小反刍兽疫的诊断、疫苗免疫水平的监控及控制其流行具有重要意义。     

庆大霉素单克隆抗体的研制及ELISA分析方法的建立

用与牛血清蛋白(BSA)交联的庆大霉素人工抗原(GM-BSA)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,得到1株能稳定分泌抗庆大霉素单抗的杂交瘤细胞株(6H8),经鉴定6H8的抗体类型及亚类均为IgG1,其轻链为κ链.制备单克隆抗体腹水,腹水的间接ELISA效价在1×10-7以上.该单克隆抗体与庆大霉素结构类似物均无交叉反应,具有高度特异性.以制备的单抗建立间接竞争ELISA方法,其线性回归方程为y=16.122ln(x)-2.0143(R2=0.9934),抑制中浓度IC50为25.2μg·L-1,最低检测限IC20为3.9μg·L-1.竞争ELISA方法检测鲜奶中的庆大霉素平均回收率在92％～110％之间.抗庆大霉素单抗的制备和竞争ELISA方法的建立为庆大霉素快速检测奠定了基础.     

番茄黄化曲叶病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立

以纯化的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)外壳蛋白为抗原,免疫家兔制备并纯化出TYLCV的多克隆抗体IgG,以此抗体做包被抗体,并用碱性磷酸酶(AP)对其进行标记作为酶标抗体,从而建立了番茄黄化曲叶病毒的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法。通过ELISA方阵试验确定该法的最佳工作浓度为酶标抗体(IgG-AP)作1∶400倍稀释,包被抗体浓度为6.25μg.mL-1;并且确定了抗原最低检出浓度为9.75ng.mL-1。采用该法对山东寿光的田间病样进行了定性和定量检测,结果表明建立的DAS-ELISA方法灵敏度高、特异性强,可用于番茄黄化曲叶病毒的常规检测。     

莱克多巴胺单克隆抗体的研制及阻断ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺(RAC)偶联于牛血清白蛋白(BSA),合成免疫原BSA-RAC,并用紫外和凝胶电泳鉴定;用BSA-RAC免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗RAC单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备RAC mAb。应用RAC mAb研制RAC残留快速检测阻断ELISA试剂盒(RAC-Kit),并测定其性能。结果表明,BSA-RAC偶联成功,分子结合比为1∶24.5;筛选出3株杂交瘤细胞,其中最好的4D8株的亲和常数Ka为1.65×1010L/mol。RAC-Kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,线性范围为1~170μg/L,灵敏度为0.52μg/L,检测限为1μg/L,饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为91.1%和89.2%,平均批内和批间变异系数<15%,与多巴酚丁胺的交叉反应率为22.3%,与其他化合物无交叉反应,RAC-Kit在4℃可保存180d。     

检测多杀性巴氏杆菌毒素抗体的单抗竞争ELISA方法的建立

本研究以纯化的多杀性巴氏杆菌毒素基因片段的原核表达产物作为抗原免疫小鼠制备单抗,并利用表达蛋白和多杀性巴氏杆菌毒素单抗酶结合物建立了竞争ELISA方法检测多杀性巴氏杆菌毒素抗体。经过研究确定抗原包被浓度为223ng／mL,待检血清最佳稀释度为1：2,酶标单抗工作浓度为1：3200,血清抑制率大于50%为阳性。应用单抗竞争ELISA和细胞毒性中和试验同时对82份血清进行猪多杀性巴氏杆菌毒素抗体检测,竞争ELISA的检出率为40.2％,细胞毒性中和试验检出率为36.6％,两者符合率达91.5％。试验结果表明,该ELISA方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性好,操作简便。本方法的建立在实验室诊断的标准化、猪群萎缩性鼻炎疫苗免疫效果的评价及流行病学调查方面具有应用价值。     

基于M蛋白检测犬瘟热抗体ELISA方法的建立

犬瘟热病毒(Canine disremper virus,CDV)是导致犬科等多种属动物发热、腹泻、幼仔死亡等症状的传染病病原体,建立针对CDV的快速灵敏的诊断方法对于该病的防治具有重要意义。本研究利用RT-PCR方法扩增得到CDV-M基因,构建原核重组表达载体p ET-28(a)-CDV-M,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现了该蛋白的表达和纯化,Western blot验证重组蛋白的抗原性,用纯化的重组蛋白his-CDV-M作为抗原包被酶标板,ELISA方阵实验确定该重组蛋白的包被浓度,建立了检测临床犬血清样品的CDV-M蛋白抗体的间接ELISA方法,比较本实验方法与其他试剂盒之间的特异性和灵敏性。结果表明重组蛋白his-CDVM得到较好表达,纯化后蛋白浓度为2.840 mg/m L。Western blot结果表明重组抗原能与犬瘟热阳性血清进行反应。方阵实验确定抗原最佳工作浓度为8.88μg/m L,抗体最佳稀释度为1∶160,应用本方法检测223份犬血清样品,与进口CDV诊断试剂盒检测结果符合率为96%。本研究建立的基于M蛋白的犬瘟热病毒抗体检测方法具有较高的特异性和灵敏性,为犬瘟热病毒的诊断及M蛋白的功能研究提供了工具。     

毒死蜱单克隆抗体的制备及鉴定

本文合成毒死蜱的半抗原并对其进行结构鉴定,将半抗原与牛血清白蛋白和鸡卵清蛋白共价偶联分别制备免疫原和包被原,再取已免疫的Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,建立2株分泌毒死蜱单克隆抗体的杂交瘤细胞。以琼脂双扩散法鉴定抗体亚类类型,间接竞争ELISA方法测定了抗体对毒死蜱的灵敏度、特异性和亲和性。结果表明该抗体分泌IgG1亚类的单克隆抗体,且与毒死蜱的亲和性较高(1.5×107 L / mol),与其他结构类似物的交叉反应均小于1%。本研究成功制备了毒死蜱特异性的单克隆抗体,为今后ELISA方法的建立提供了条件。     

基于双特异性单克隆抗体的克百威和三唑磷多残留ELISA分析方法研究及在环境样品中应用

采用杂交-杂交瘤技术制备抗克百威和三唑磷的双特异性单克隆抗体并进行纯化,通过对反应模式、工作浓度、包被缓冲液、有机溶剂、离子强度、pH值等条件优选,建立优化的ELISA分析方法,对克百威和三唑磷的线性回归方程分别为Y=20.0091n(x)-9.9293(R2 =0.9959)和Y=19.486In(x)+39.752 (R2=0.9945),抑制中浓度I50分别为20ng·mL-1和1.69ng· mL-1,最低检测限I20分别为4.46ng·mL-1和0.36ng· mL-1.建立的ELISA分析方法对水、土壤等环境样品中克百威和三唑磷的平均添加回收率介于88.4％ ～117％之间,说明所制备的双特异性单克隆抗体和建立的ELISA分析方法可靠,可应用于克百威和三唑磷的多残留免疫分析.     

检测马西尼罗热病毒抗体的重组E蛋白-ELISA的建立

摘要：重组质粒pET-E转化宿主菌 BL21，经1.0mmol/L IPTG 诱导，外源基因以包含体的形式获得高效表达。通过Western blotting 检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测WNV抗体的间接ELISA方法。结果表明，抗原的最佳稀释度为8.6ug/mL，血清的最佳稀释度为1：100，待检血清阳性标准初步定为：OD490nm＞2.1×OD490阴性。用此方法检测了450 份血清样品，结果全为阴性。     

BBTV单克隆抗体的制备及其检测应用

香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是危害香蕉(Musa paradisiaca)生产的重要病毒.本研究旨在以制备的抗BBTV特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)为核心建立检测BBTV的血清学方法,从而为该病毒的诊断和科学防控提供技术支撑.通过改进提纯方法获得了提纯的BBTV,以BBTV病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),经细胞筛选和克隆,获得1株分泌抗BBTV单克隆抗体的杂交瘤细胞22E3,并制备其单抗腹水.用间接酶联免疫吸附试验(indirect-enzyme-linked immunosorbent assay,in-ELISA)方法测定制备的单抗腹水效价达到10-7,抗体类型及亚类为IgG1,κ轻链.Western blot检测表明,该单抗与BBTV外壳蛋白亚基有特异性反应.利用制备的单抗建立了检测BBTV的斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA).该方法检测感染BBTV香蕉植物组织粗提液呈特异性阳性反应,而和健康香蕉组织呈阴性反应,说明建立的dot-ELISA方法能特异性地检测香蕉植物组织中的BBTV.灵敏度分析表明,以22E3单抗为核心建立的dot-ELISA方法检测香蕉病组织的灵敏度达1∶640(W/V,g/mL).田间样品检测结果表明,建立的dot-ELISA方法能准确、可靠地用于香蕉中BBTV病毒的检测.BBTV单克隆抗体的制备及其dot-ELISA血清学检测方法的建立为我国香蕉上BBTV的诊断、无毒苗的生产及科学防控提供了物质和技术支撑.     

小麦Rubisco抗体的制备和旗叶中Rubisco含量的ELISA测定

Rubisco(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶)为光合生物中的关键性酶。以小麦(Triticum aestivum L. cv.)叶片为材料，在(NH4)2SO4盐析和DEAE-Sepharose F F层析纯化的基础上添加了Sephacryl S 300分子筛，进一步纯化了Rubisco。 将纯化的Rubisco免疫大白兔制备了Rubisco的多克隆抗体， 经Western blot检测，Rubisco抗体与Rubisco呈免疫反应特异性。并运用Rubisco抗体，采用ELISA方法直接测定小麦旗叶生长发育过程中Rubisco含量的变化，结果表明：不同生长阶段，旗叶的Rubisco含量与光合速率大小呈正相关。该方法比免疫沉淀法更为快捷、准确。     

喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学特性的鉴定

通过质谱法鉴定合成喹乙醇-半琥珀酸酯(OLA-HS),紫外法及凝胶电泳法鉴定全抗原OLA-BSA和OLA-OVA后,使用杂交瘤技术制备喹乙醇单克隆抗体(OLA mAb),对其效价、亲和力、敏感性、特异性及亚型进行鉴定,并通过体内诱生腹水法进行大量制备。试验结果表明,本研究成功制备了OLA-HS,且半抗原与载体蛋白偶联成功;筛选出的5株杂交瘤细胞单抗同种型均为IgG1,细胞培养上清间接ELISA效价在1∶3.0×102～1∶1.28×103之间,用4E12细胞株制作的腹水效价为1∶5.12×105。OLAmAb亲和常数Ka为3.75×1010L/mol,对OLA的IC50为1.51ng/ml,且具有较好的特异性。试验获得了高效价、敏感、特异的OLA mAb,可用于动物性食品中OLA残留检测的免疫学试验。     

兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单克隆抗体的制备及潜在应用

制备兔多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单抗,为兔多杀性巴氏杆菌病的诊断提供特异性强,灵敏度高的单克隆抗体。本研究选取并扩增Pm外膜蛋白基因OmpA,原核表达获得了的大小为37.6kD的OmpA重组蛋白,以纯化复性的兔多杀性巴氏杆菌OmpA重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),取其脾细胞与SP2/0细胞融合,ELISA筛选出了4株分泌Pm OmpA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5D2、BC11、2A2和6A4。其中2A2细胞培养液效价为1∶256,5D2、BC11和6A4效价为1∶128;2A2腹水效价为1∶12800,其余3株达1∶6400。杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代,仍能稳定分泌高效价抗体。Western blot显示,4株单克隆抗体均能与Pm OmpA重组蛋白重组发生特异性反应。用ELISA方法鉴定2A2单克隆抗体亚型为IgG2b,Protein A亲和纯化2A2腹水抗体,获得的单抗浓度为130μg/mL。选取纯化的2A2单克隆抗体进行潜在应用研究,Western blot与间接免疫荧光结果显示,单克隆抗体能与兔多杀性巴氏杆菌分离菌株发生特异性反应。表明利用体外重组表达兔多杀性巴氏杆菌OmpA融合蛋白制成的杂交瘤能够稳定分泌效价高、特异性强的单克隆抗体,可用于兔多杀性巴氏杆菌诊断,本研究结果为兔多杀性巴氏杆菌诊断试剂盒的研制提供技术参数。     

猪水肿毒素A亚基基因表达产物的生物学特性及抗体检测ELISA方法的建立

根据TMpred生物学软件对SLT-ⅡeA亚基的蛋白质结构分析结果,表达了猪水肿毒素(SLT-Ⅱe)A亚基。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达产物以可溶形式存在,易于纯化且具有良好免疫学活性。生物学毒性试验表明,表达产物不能致死小白鼠,也不具有Vero细胞毒性。体外细胞毒性中和试验表明,表达产物的兔抗血清能中和天然SLT-Ⅱe(中和度90.4℅)。在小鼠免疫保护力试验中,表达产物作为免疫原不能提供任何保护力。以表达产物为抗原建立检测SLT-Ⅱe抗体的间接ELISA方法,结果该方法对猪萎缩性鼻炎等9种常见细菌性疾病阳性血清的检测均为阴性,能特异性检测到人工感染猪水肿毒素8d仔猪的血清抗体IgG,对临床送检的1083份猪血清的检测阳性率为20.9℅。     

抗苯巴比妥单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及ciELISA试剂盒的研制

用BSA-pAPB免疫Balb/c小鼠，用细胞融合技术制备并用间接ELISA和阻断ELISA筛选抗苯巴比妥单克隆抗体(PB mAb)杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法生产PB mAb，应用PB mAb研制PB残留竞争ELISA(ciELISA)快速检测试剂盒(PB-Kit)，并测定其性能。结果表明，筛选出3株杂交瘤细胞，最好的3F6-C4株的PB mAb间接ELISA效价为1∶6.4×105，亲和常数(Ka)为1.96×1010 L/moL，半数抑制浓度(IC50)为5.7 μg/L，与巴比妥的交叉反应率(CR%)12.4%，与其它化合物无CR；PB-Kit的线性检测范围1.0～81 μg/L，灵敏度0.75 μg/L，检测限1 μg/L；饲料样和猪尿样的平均添加回收率85.8%和91.3%，平均批内和批间变异系数均<15%。PB-Kit具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合PB残留快速检测的推广应用。     

高亲和力大豆凝集素单抗制备及免疫学特性鉴定

为制备高亲和力的大豆凝集素(SBA)单克隆抗体,本试验以50μg SBA蛋白/200μL乳化液/只的剂量免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定多抗血清效价和灵敏性。选择血清效价和灵敏性较好的小鼠进行细胞融合。通过有限稀释亚克隆筛选出能稳定分泌SBA单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法批量制备SBA单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,SBA免疫的4只小鼠中,1号小鼠效价最高且灵敏性最好,半数抑制浓度(IC₅₀)为571.4μg·L^-1。选取该小鼠进行细胞融合,并最终得到1株杂交瘤细胞,命名为5B4E10。制备的SBA单克隆抗体的效价达到1∶409 600以上,IC₅₀为82.04μg·L^-1,亚型为IgG1型,亲和力常数(Ka)为1.83×10⁹ L·mol^-1。且该抗体与大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和其他抗营养因子无交叉反应。本研究结果为建立大豆及其制品中SBA的免疫学检测方法奠定了良好的抗体基础。