猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原共表达的复制缺陷型重组腺病毒构建及鉴定

通过RT-PCR技术和重叠PCR技术扩增出含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的A抗原表位和D抗原表位,构建复制缺陷型腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒经PacI线性化之后,共同转染AD-293细胞,获得共表达A、D抗原表位的复制缺陷型重组腺病毒。经Western Blotting检测,该重组腺病毒能够正确表达目的蛋白基因,而且目的蛋白能够与猪传染性胃肠炎阳性血清反应。本研究结果为猪传染性胃肠炎重组疫苗研发奠定基础。     

携带Apoptin及hTERT启动子的双重特异性重组腺病毒的构建及鉴定

从质粒pMT-E1a和pIRES-neo中获得目的基因E1a和PolyA并连接入质粒pKS-hTERTp,用XhoⅠ和SpeⅠ双酶切后连接入线性化的pAd-Apoptin,获得穿梭载体pAd-apoptin-PolyA-hTERTp-E1a。穿梭载体pAd-ApoptinPolyA-hTERTp-E1a和腺病毒骨架质粒(pAd5)共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a,采用RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,MTS法检测病毒对A549细胞的抑制作用;绘制重组腺病毒生长曲线,监测重组腺病毒在细胞内的复制能力。结果显示:构建出的重组腺病毒中包含有了目的基因Apoptin和E1a,并且目的基因在细胞中正确的表达;MTS结果显示重组腺病毒对A549具有抑制作用,且抑制作用具有一定的时效及剂效关系;重组腺病毒具有在A549细胞中正常复制的能力。结果表明:成功的构建出了具有特异性杀伤和特异性复制能力的双重特异性重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a。     

Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3 895和1 752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60...     

猪流感病毒NP基因重组复制缺陷型腺病毒的构建与表达

以含有猪流感病毒A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)NP基因的重组质粒pMD18-NP为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增NP基因,将其亚克隆至质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有NP及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-NP-EGFP。利用脂质体转染法将穿梭质粒pDC315-NP-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选到重组腺病毒rAd-NP-EGFP。经PCR和Western blotting鉴定,结果表明NP基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物学活性。重组腺病毒rAd-NP-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.26×1010/mL,为进一步研究该重组病毒的免疫原性奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒重组腺病毒疫苗的构建及小鼠免疫试验

通过RT-PCR和重组PCR技术扩增出猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)疫苗株sM、M、S基因,构建重组腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与BJ5183细菌同源重组构建同源重组腺病毒质粒,同源重组腺病毒质粒经Pac Ⅰ酶切后转染AD-293细胞,获得3个含有目的基因的重组腺病毒。将3个具有感染能力的复制缺陷性重组腺病毒共同感染Vero细胞,细胞上清液进行小鼠免疫特性研究。结果表明,共同感染Vero细胞所得蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

表达牛分枝杆菌MPB83基因重组腺病毒的构建

以牛分枝杆茵Vallee III株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得MPB83基因,克隆后.亚克隆至腺病毒穿梭栽体pShuttle-CMV中,构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MPB83经Pme I酶切,转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-I的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-MPB83.Pac I酶切线性化该质粒,转染AD-293细胞进行病毒包装,转染细胞10 d后出现细胞病变(CPE).PCR、RT-PCR、western blot检测到重组病毒含MPB83基因并成功表达.     

大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及应用

以大肠杆菌pMB1复制类型质粒pUC18为模板,PCR扩增了700bp的含质粒复制起始点和复制蛋白序列的DNA片段,克隆到质粒pBluskm的多克隆位点,得到含大肠杆菌质粒复制基因的中间载体pE3;以革兰氏阳性菌质粒pGDV1为模板,PCR扩增了含革兰氏阳性菌质粒正负链复制区域的2·5kb片段,并与pE3载体上的大肠杆菌复制子和复制蛋白连接构建了3·2kb的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103。电转化pGJ103质粒至枯草杆菌DB104和1A747,均能稳定地复制。以pGJ103为骨架,克隆了不同大小的生物素基因片段,均能正确稳定地复制,证明载体有良好的承载能力。将2kb的热稳定性β-半乳糖苷酶基因(bga)克隆至pGJ103构建了载体启动子检测载体pGJ199。用pGJ199质粒载体作为启动子检测载体,对革兰氏阳性菌启动子片段P59进行了转录活性检测。并以该载体为启动子探测工具,通过鸟枪法得到了大量启动子片段。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。     

细菌耐药机理与抗菌药物的合理应用

一、细菌的耐药机理抗生素广泛用于临床后,细菌可在数月或数年间对其产生耐药性。细菌基因的突变是导致细菌产生耐药的根本原因,在一个感染周期中,处于对数生长期的细菌突变率约为1/107,如该突变可对抗生素耐药,将使细菌在敏感菌被杀灭后迅速繁殖成为优势菌。在抗生素的选择性压力下,突变率可成百倍增加,并极易发展为多重耐药。耐药性的迅速扩散通常由携带抗生素耐药性的质粒在不同种属的细菌间穿梭和复制所导致,高度耐药的细菌常同时涉及以下几种耐药机理。1.主动泵出机理药物在达到靶位发挥作用之前,必须通过G-菌的外膜和内膜、G 菌胞壁…     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列(登录号:CP002525.1)设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用KpnⅠ和XhoⅠ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR~259中,构建PCR~259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR~259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法(IFTA)检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列(登录号:CP002525.1)同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR~259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR~259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR~259-ENO构建成功。     

猪圆环病毒2型ORF1部分位点突变对病毒复制能力的影响

猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果：将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。     

表达猪白细胞介素2重组腺病毒的构建

为构建表达猪白细胞介素2(IL-2)的复制缺陷型重组腺病毒,本研究提取经刀豆球蛋白A(con A)刺激体外培养的长白猪外周血淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR扩增猪IL-2基因,并克隆于质粒pIRES2-EGFP中,将含有IL-2及EGFP的基因片段亚克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315中,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-IL-2-EGFP.利用脂质体转染方法将pDC315-IL-2-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔEl,E3Cre共转染HEK293细胞.根据腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP的荧光信号筛选重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.经western blot鉴定,结果表明获得了一株能够表达猪IL-2蛋白的重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.本研究为进一步研究猪IL-2在疫苗免疫中的增强作用及研制新型免疫增强剂奠定了基础.     

猪链球菌2型srtA基因缺失菌株的构建及生物学特性

扩增了srtA基因的上、下游同源臂P1和P2及其全长序列,利用温度敏感型"自杀性"质粒pSET4s构建了重组质粒pSET4s-P1-P2,并将该质粒电转化入野生菌株SS2(SC21)中,通过抗生素和温度双重筛选,得到srtA基因缺失菌株,命名SC211.同时,将srtA基因定向插入穿梭质粒pAT18,构建穿梭质粒pAT18-srtA,并将该质粒电转入srtA基因缺失菌株SC211中,通过抗生素筛选,得到质粒介导的srtA基因互补菌株SC212.通过PCR、South-ern blotting等对缺失突变菌株和互补菌株进行了鉴定.对基因缺失突变菌株和回复菌株传代培养遗传稳定性试验结果显示,缺失突变菌株和互补菌株能够稳定遗传.比较了基因缺失突变菌株、互补菌株及野生菌株的生长特性、溶血活性、细胞粘附特性,结果表明,3个菌株的生长速度、溶血活性没有明显差异.基因缺失后SS2对Hep2细胞的粘附能力明显下降,只有野毒菌株的49%,互补菌株粘附能力几乎达到野毒菌株的水平,是野毒菌株的89%.CD1小鼠毒力试验结果显示,srtA基因缺失株SC211的LD_(50)(4.93×10~7)约为野毒菌株SC21的LD_(50)(8.21×10~6)的6倍,质粒介导的互补菌株SC212的LD_(50)(1.43×10~7)是野生菌株SC21的1.7倍,接近野毒菌株的水平,说明srtA基因缺失后SS2毒力显著下降.     

FMDV全ORF编码基因的克隆及其腺病毒穿梭质粒的构建

为研制FMD复制缺陷型腺病毒活栽体疫苗，通过RT—PCR方法获得了。型口蹄疫病毒（FMDV）全开放阅读框（oRF）基因片段，将其克隆到pMD18-T栽体后测序，再将oRF编码基因定向克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack—CMV中，构建了重组腺病毒穿梭质粒。经PCR、酶切及测序鉴定，所克隆的oRF编码基因序列与原始强毒株Akesu／58的ORF编码基因比较，L、P1、P2、P3基因的核苷酸同源性分别为98．8％、97．9％、99．0％和97．6％，PCR、酶切鉴定重组腺病毒穿梭质粒均获得了长约6．9kb的目的基因片段。表明，成功获得了含有。型FMDV全ORF编码基因的阳性克隆，并成功构建了含有完整FMDV开放阅读框架的编码基因表达盒的重组腺病毒穿梭质粒。     

H5N1禽流感病毒NA基因重组腺病毒表达载体的构建

构建携带有H5N1亚型AIV NA基因的重组腺病毒表达载体,为进一步研究AIV中NA基因在病毒致病过程中的作用及相关诊断试剂的开发提供依据。采用PCR的方法从构建好的包含有H5N1AIV NA基因的pMD-19T-N1质粒中扩增出NA基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-N1与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-N1,将pAdeasyd-N1经pacⅠ线性化后转染HEK293细胞株,包装出含有NA基因的腺病毒pAd-N1。结果表明,构建含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-N1和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-N1经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-N1转染HEK293细胞,成功获得腺病毒pAd-N1载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。     

猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明：试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;...     

弧菌科质粒pJV的全序列测定、基因预测及其复制区的鉴定

为了从条件致病菌鳗弧菌中提取到天然质粒,获得该质粒的全序列,并得到在弧菌中起复制作用的区域,试验采用向上引物和向下引物共9条,双向测通该质粒,经拼接得到质粒p JV的全序列,利用Glimmer3基因预测软件对该质粒可能包含基因模型进行预测和基因注释,通过在线工具OriFinder预测分析该质粒的复制区域,并将该区域克隆到T载体中,验证重组质粒在弧菌科菌种中的复制效果。结果表明:该质粒p JV全长5 982 bp(Gen Bank登录号为JQ782192),有4个含有核糖体结合位点的基因(UQY-2、UQY-3、UQY-4、UQY-6);质粒p JV的复制元件是一段长313 bp的序列(含Dna A boxes)。说明经过试验验证,该片段使T载体具有在维氏气单胞菌中复制的能力,即证明该片段为鳗弧菌质粒p JV的复制区,可用于新弧菌科载体的构建和疫苗研制等。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性的初步分析

拟构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QS10株S1蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒,并在本动物上进行初步的免疫学试验。通过RT-PCR获得S1基因,插入腺病毒表达系统穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-S1,转染293AD细胞获得表达S1蛋白的重组腺病毒。PCR检测显示,S1基因已重组到腺病毒基因组;间接免疫荧光和Western blot检测证明该重组病毒在293AD细胞中真实表达了具有免疫反应性的IBV S1糖蛋白。重组病毒培养滴度可达到107 TCID50.mL-1。免疫接种SPF鸡后,通过ELISA检测,免疫鸡产生了针对IBV的特异性抗体。作者成功构建了表达IBV S1蛋白的重组腺病毒,该重组病毒可在SPF鸡体内诱导产生IBV特异性抗体。     

密码子优化的鸡白细胞介素-17在昆虫细胞中的表达研究

为了获得具有良好生物学活性且具有较高表达量的鸡白细胞介素-17(ChIL-17),本研究在前期研究工作基础上,将ChIL-17的编码基因按照真核细胞(昆虫细胞)偏爱的密码子进行优化改造,经全基因合成后插入到转座载体pFastBacTM Ⅰ中,构建重组转移质粒pfast-mod.ChIL-17并转化DH10Bac感受态细胞.通过位点特异性转座将mod.ChIL-17基因整合到穿梭质粒Bacmid中,获得重组穿梭质粒Bacmid-mod.ChIL-17.应用脂质体将重组穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-mod.ChIL-17.重组病毒传代扩增感染Sf9细胞,通过间接免疫荧光检测目的蛋白的表达.结果表明,经过优化的ChIL-17在杆状病毒系统中获得表达.