大肠杆菌铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与序列测定

试验以E.coliMG1655的基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增sodC基因,PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coliDH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行SacI和KpnI酶切及PCR扩增鉴定,并对sodC基因片段进行序列测定。试验成功克隆了sodC基因,获得的基因与报道的sodC基因序列同源性达到99.6%,为进一步构建重组表达载体奠定了基础。     

犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建

根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。     

犬新孢子虫吉林株SAG1基因真核表达载体的构建

根据GenBank中已发表的犬新孢子虫SAG1基因序列(AF132217),设计了一对含有Kozak序列、起始密码子、终止密码子、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物。以含有SAG1基因的重组质粒pMD-18T-SAG1为模板,经PCR扩增获得SAG1基因,利用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切该片段,回收含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点粘性末端的SAG1基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAX1真核表达载体中,获得重组质粒pVAX1-SAG1,经PCR鉴定、酶切分析和重组质粒的序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白与幽门螺杆菌铁蛋白基因融合PCR扩增及其真核表达载体的构建

为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌（Hp）铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白与幽门螺杆菌铁蛋白基因融合PCR扩增及其真核表达载体的构建

为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌(Hp)铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。     

新孢子虫SAG1-SRS2融合基因真核表达质粒的构建及表达

根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSAG1-NcSRS2融合基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSAG1-SRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到COS-7细胞中进行瞬时表达,经免疫荧光检测,证实了该载体能在细胞内进行蛋白表达。     

鸡柔嫩艾美尔球虫ZJ株3-1E基因的原核表达及鉴定

本实验对E．tenellaZJ株的3-1E基因进行了克隆和表达。根据已报道的柔嫩艾美尔球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增得到一条特异片段,将扩增产物克隆至pUCM—T,转化感受态菌DH5仅,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99．5％。然后将重组质粒和表达载体pET-30a分别以EcoRⅠ、SalⅠ酶切后构建重组表达载体pET-30a-3—1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS—PAGE和Westernblot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子量约为27ku,诱导6h的蛋白表达量可达到47、024％。     

牛新孢子虫NcSRS2基因腺病毒穿梭载体的构建及在293细胞中的表达

应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2（AF061249）核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。     

犬新孢子虫NcSRS2基因真核表达质粒的构建

根据犬新孢子虫NcSRS2基因序列，设计了1对含有Kozak序列、PstⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物，以含有NcSRS2基因的质粒P43为模板，经PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段，用PstⅠ和XbaⅠ双酶切该片段，回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSR2 ORF基因，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3．1（＋）真核表达载体中，获得重组质粒pcNCSRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段序列测定、比较，证实了重组质粒的正确性。     

鸡柔嫩艾美耳球虫ZJ株TA4基因的克隆及原核表达

本试验对E．tenella ZJ株的TA4基因进行了克隆和表达。根据已报道的柔嫩艾美尔球虫TA4基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT—PCR的方法扩增得到一特异片段,将扩增产物克隆至pMD18-T,转化DH5-α感受态,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99．1％。然后将重组质粒和表达载体pGEX-4T2分别以EcoR I、Xho I酶切后构建重组表达载体pGEX—TA4,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS—PAGE和Western blot检测显示,TA4基因在大肠杆菌中获得表达;融合蛋白的分子量约为43ku,以包涵体形式存在;诱导6h的蛋白表达量可达到35.9％,采用抗GST抗体进行Western blot,成功检测到了该特异性条带。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达

将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因.     

多房棘球绦虫钙网蛋白的表达及其与补体组分C1q的相互作用分析

为表达多房棘球绦虫钙网蛋白EmCRT,并对其进行初步鉴定及结构与补体结合功能分析.本研究以多房棘球绦虫囊cDNA为模板,通过PCR扩增目的基因,克隆至pcDNA3.3-Myc载体,构建重组质粒pcDNA3.3-Myc-EmCRT;PCR、酶切及测序鉴定其正确后,以脂质体转染法转染Hela细胞,运用Western blo...     

捻转血矛线虫Hc38保守结构域所在基因片段的真核表达载体构建

根据捻转血矛线虫Hc38基因产物(登录号AY749124)保守结构域所在核酸序列设计1对引物,该引物包含Kozak序列、HindⅢ酶切位点、Xba Ⅰ酶切位点.以含有捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域片段的pMD19-T为模板,经PCR扩增获得Hc38基因保守结构域片段,用HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切该片段,回收后将此基因片段克隆至相同酶切回收后的真核表达载体pcDNA3.1(+)中,获得重组质粒pcD-NA3.1-Hc38.经酶切分析、序列测定和PCR鉴定,证实了重组质粒的正确性.     

牛新孢子虫NcSRS2基因真核重组质粒的构建及鉴定

为了解牛新孢子虫NcSRS2基因的生物学特性,试验扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,亚克隆至pMD18-T载体后进行PCR鉴定、酶切鉴定及测序分析,最后克隆至pVAXⅠ真核表达载体中,并进行PCR鉴定和酶切鉴定。结果表明:牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227 bp,与GenBank中发表的NcSRS2(AF061249)核苷酸序列同源性为99%;构建的真核重组质粒pVAXⅠ-NcSRS2正确。     

气肿疽梭菌CctA基因真核表达载体的构建与鉴定

为了构建气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因真核表达载体,探讨制备安全有效气肿疽核酸疫苗的可行性,试验根据NCBI上气肿疽CctA基因序列,通过Primer Premier 5.0设计了1对特异性引物用于基因扩增,将PCR扩增的CctA基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒pMD19-T-CctA,对测序正确的基因进行序列分析后亚克隆至pVAX-1真核表达载体,并对构建的pVAX1-CctA真核表达质粒进行PCR和双酶切鉴定。结果表明:成功扩增了CctA基因目的片段,并获得了与预期大小相符的重组质粒pMD19-T-CctA和真核表达质粒pVAX1-CctA。说明试验成功构建了气肿疽CctA基因真核表达载体。     

牛脂联素基因cDNA克隆

应用RT-PCR方法先提取成牛肝脏外部脂肪和犊牛大网膜前脂肪细胞培养物(第13日龄)总RNA,先后扩增出ADPN cDNA的501 bp片段基因,分别克隆到载体PMD18-T中,构建重组载体PMD18-T/牛ADPN1和PMD18-T/牛ADPN2。筛选出阳性克隆,通过限制性内切酶酶切鉴定和重组质粒PCR鉴定后对其进行测序。结果表明：ADPN1和ADPN2 2次测序结果完全一致；从脂肪组织总RNA中扩增得到501 bp片段ADPN基因,其cDNA序列与GenBank牛ADPN基因序列同源性为85%,其氨基酸同源性为96%。     

鸡柔嫩艾美耳球虫HN株3-1E基因的原核表达与鉴定

根据已报道的柔嫩艾美耳球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到1条特异片段,将扩增产物克隆至p MD-18T载体,转化感受态菌JM109,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与已发表的国内外相关虫株的3-1E基因序列比较,核苷酸的同源性均在99.2%~99.8%,氨基酸的同源性均在98.2%~100%。然后将重组质粒和表达载体p GEX-4T-1分别用Xho I和EcoR I酶切后构建重组表达载体p GEX-3-1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白的分子量为44.7 ku,诱导表达5 h的蛋白表达量可达到30%以上。     

绿色荧光蛋白在秀丽隐杆线虫中的表达

为探讨增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在秀丽隐杆线虫体内的异源表达,以及电穿孔技术在线虫基因转化中应用的可能性,根据秀丽隐杆线虫Act-1基因序列设计引物,以其基因组DNA为模板,进行PCR扩增,成功扩增出Act-1启动子。将PCR产物与pUCm-T载体连接后,转化至DH5α感受态细胞,筛选出阳性克隆并测序。pEG-FP-N1真核表达载体经双酶切去掉CMV启动子序列,补平自连成载体pEGFP-4.1(4.1kb)。pEGFP-4.1和T载体上的Act-1启动子序列分别经双酶切,连接筛选阳性克隆,并进行酶切鉴定构成pAct-EGFP绿色荧光蛋白表达载体。通过电穿孔法转化秀丽隐杆线虫,通过PCR检测及激光共聚焦显微镜观察发现绿色荧光基因在虫体有明显的表达。     

牛瑟氏泰勒虫重组腺病毒载体Ad-p33的构建与鉴定

为了研究并构建出牛瑟氏泰勒虫p33基因重组腺病毒载体,试验根据GenBank(D87198)上发表的牛瑟氏泰勒虫p33基因序列设计合成1对特异性引物,采用PCR技术扩增p33基因,克隆至pMD18-T Simple载体后,亚克隆到腺病毒穿梭载体pCR259中,将经酶切鉴定和PCR鉴定正确的重组穿梭质粒pCR259-p3...     

牛白细胞介素2基因原核表达及多克隆抗体制备

根据GenBank发表的牛白细胞介素2(BoIL-2)基因序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增出重组牛白细胞介素2(rBoIL-2)基因。将克隆片段与pMD18-T载体连接,并经过酶切及PCR鉴定,测序结果显示,克隆的BoIL-2基因与GenBank发表的BoIL-2基因序列同源性为98.7%。将测序正确的克隆片段与pET30a(+)载体连接,构建重组表达质粒pET30a(+)-rBoIL-2,通过双酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒进行序列测定后在大肠杆菌的表达,分子质量约为23.49 ku;表达产物主要分布在包涵体中。Western blotting证实所得到的重组蛋白为BoIL-2重组蛋白。用镍离子亲和树脂对所得的BoIL-2重组蛋白进行纯化,并免疫新西兰兔成功制备兔抗rBoIL-2多克隆抗体,为下阶段的研究提供了重要的试验材料。