一株基因Ⅶ型新城疫病毒的分离及分子鉴定

从一起新城疫暴发的病例中分离出1株新城疫病毒（NDV），命名为铜山分离株（TS）。运用RT-PCR技术，克隆了该分离株F基因的重要功能片段（约0.5kb)，并进行了序列测定。序列分析表明，TS分离株在F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为^112-R-R-Q-K-R-F^117，与NDV强毒株特征相符，且具有101外的K（赖氨酸）和121处V（缬氨酸）2个特征性氨基酸，与基因Ⅶ型NDV的特性完全相符。     

新城疫病毒广东基因Ⅶ型分离株的分离鉴定及F基因克隆与序列分析

2011年从广东一疑似新城疫病毒感染的养禽场通过SPF鸡胚接种试验、HA及HI试验和动物回归试验,生物学毒力指标(MDT,ICPI)测定,分离到一株新城疫毒株,命名为GD-X1-2011,并对该毒株进行了F基因的序列测定分析.GD-X1-2011株的MDT为45 h＜60 h,ICPI为1.88＞ 1.6,分离毒株具有血凝性且能被NDV La Sota标准阳性血清抑制,动物回归试验鸡出现典型的新城疫症状.毒株GD-X1-2011F基因的裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,属于强毒裂解序列,其F基因与基因Ⅶ型毒株SD-WF07-2011同源性为97.5％,与其他不同基因型毒株的同源性在83.6％～90.1％之间.进化树分析GD-X1-2011株属于基因Ⅶ型毒株.     

基因Ⅶ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据基因ⅤⅡ型新城疫病毒F基因裂解位点特征设计一对引物和TaqMan探针,建立一种敏感、特异、重复性良好的基因ⅤⅡ型毒株荧光定量RT-PCR鉴别检测方法。以体外转录法制备的cRNA标准品为标准阳性模板,构建标准曲线,并进行各项指标的检测。结果表明,建立的方法特异性良好,最低可检测到102拷贝·μL-1的模板RNA,敏感性比普通RT-PCR高100倍。本试验建立了基因ⅤⅡ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法,且该方法能够鉴别检测常规方法不能区分的新城疫病毒基因ⅤⅡ型强毒株,表明本研究建立的方法可用于此种基因型毒株的快速鉴别检测。     

一株新城疫基因Ⅶ型病毒株的分子生物学鉴定

从鹤壁某患病鸡群中分离到一株病毒（ＨＢ９７）,该病毒用单克隆抗体鉴定为新城疫强毒株。但其抗原性与新城疫Ｆ４８Ｅ８株有明显差异。经过对Ｆ基因的扩增、克隆、测序及与其他毒株的 Ｆ基因序列比较,表明该毒株为新城疫基因Ⅶ型。这为更好地控制和预防新城疫提供了依据。     

某规模场产蛋量下降鸡群新城疫病毒分离与鉴定

对某规模场鸡群采集的23份鸡咽喉或泄殖腔棉拭子进行病原分离,通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测,证实分离出17株新城疫病毒(NDV)。对F、HN基因经RT-PCR扩增、克隆并对其进行测序,选取具有代表性的4个毒株进行序列比对及遗传演化分析。系统发育分析结果表明,4株病毒均属于基因Ⅶe型,F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,具备NDV强毒株裂解位点氨基酸排列特征。其F基因与XZ-12-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性分别介于96.1%~96.7%、97.3%~98.0%;与P1株核苷酸和氨基酸的同源性分别介于95.0%~95.4%、96.2%~96.7%,其HN基因与XZ-12-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性介于96.2%~96.5%、95.3%~95.9%;与SN-5-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性介于94.9%~95.3%、96.4%~96.8%。血清学交叉试验显示,NDV分离毒株为抗原测得的同批血清样品抗体效价存在显著差异。近年流行的新城疫疫情主要由基因Ⅶ型NDV引起的,该规模场产蛋量下降可能与F和HN基因的变异有关。     

基因Ⅶ型新城疫病毒样颗粒作为疫苗候选株的免疫效果

利用昆虫细胞/杆状病毒表达载体系统,将已构建编码新城疫病毒(NDV)M、F和HN结构基因的3种单顺反子重组杆粒共感染悬浮培养的Sf9细胞以大量制备新城疫病毒样颗粒(ND VLPs)。收集细胞培养上清经超速离心浓缩,蔗糖密度梯度纯化后,利用Western blot检测和透射电镜观察。结果显示,3种目的蛋白均正确表达且组装形成与原病毒粒子形态相似的颗粒,测定其血凝活性效价可达12log2。动物试验结果表明,与LaSota灭活油乳苗相比,将纯化后的病毒样颗粒以含25μg蛋白的剂量或联合佐剂免疫商品蛋鸡后能产生较高水平的HI抗体,且可有效减少攻毒鸡只口咽、泄殖腔途径的排毒时间,从而减少病毒在健康鸡群中的传播感染机会;表明所研制的基因Ⅶ型ND VLPs可作为疫苗候选株具有很大的防控优势。     

一株新城疫病毒鹧鸪分离株分子生物学特性的研究

本研究从一例鹧鸪暴发新城疫的病例中成功分离出一株新城疫病毒(NDV)。运用RT-PCR扩增了该分离株F基因的重要功能片段(约535kb),并进行了序列测定。序列分析表明其在F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV的强毒株特征相符。通过构建NDV的F基因遗传进化树,发现该分离株在分类地位上属于基因Ⅶ型NDV,与同期我国普遍流行的基因Ⅶ型NDV在遗传进化上极为相似,且具有较高的同源性,表明它们可能具有共同的来源。     

新城疫病毒强毒株的分离鉴定

鸡新城疫是危害我国养禽业的一种严重的烈性传染病。经过多年的综合防制 ,已经基本控制了该病的爆发 ,典型新城疫的发生已逐渐减少。但是 ,1999年 10月以来 ,一些地区相继发生一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状并致部分鸡死亡的急性传染病 ,严重影响了该地区养鸡业的发展 ,给养鸡户造成很大的经济损失。为了尽快查明病因 ,以便制定有效的防制措施来控制该病的流行 ,我们对该地区采集的病料进行了病原分离鉴定 ,并对分离毒株的生物学特性进行了测定 ,现将试验方法和结果报道如下。1　材料和方法1.1　材料SPF鸡胚 ;1日龄SPF雏鸡 (自…     

2008年江苏地区基因Ⅶd亚型新城疫病毒遗传变异分析

为了研究基因Ⅶ d亚型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的分子流行病学及遗传变异规律,作者对2008年分离自江苏地区16株具有一定代表性NDV分离株的F和HN基因片段进行了扩增.根据F基因和HN基因序列绘制的2个遗传进化树基本一致,表明分离株中不存在囊膜糖蛋白基因发生重组的NDV;同时,HN蛋白线性表位发生E347K突变的变异株的分离率在我国呈上升趋势.基因Ⅶd亚型变异株的出现应引起相关领域从业者们的高度重视.     

西藏林芝新城疫病毒分离与初步鉴定

西藏林芝地区某牧场出现藏鸡大量死亡情况,临床症状与新城疫极为相似。笔者采集病料,根据病理剖检结果和实验室细菌学、血清学、病毒学检测结果,鉴定该牧场发生新城疫疫情。分离到的毒株血凝价为28,能被ND阳性血清抑制,不能被禽流感(H9和H5)阳性血清抑制。     

鸽新城疫病毒弱毒株的分离与鉴定

对某鸽场送检的6只通过病理剖检疑似新城疫(ND)的病鸽进行实验室诊断,包括细菌分离、新城疫病毒荧光RT-PCR检测、SPF鸡胚分离与鉴定,并测定其鸡胚分离物F3代EID50和ICPI.结果为内脏病料新城疫病毒荧光RT-PCR检测为阳性;SPF鸡胚分离到一株有血凝活性的病毒,经HA和HI鉴定为NDV,其F3代血凝价为1∶26,EID50为107.63,ICPI为1.19.根据病鸽的临床症状、鸡胚分离物EID50和IC-PI,确定该鸽新城疫病毒分离株为弱毒株.     

一株新城疫病毒弱毒株的分离鉴定

于１９９６年８月从长春地区－－养鸡场分离到一株新城疫病毒,该毒株经过鸡胚传代培养,病毒形态学观察,血凝谱测定、鸡胚平均致死时间试验、鸡脑内致病指数试验、脉致病指数试验及１入毒试验等生物学特性结果表明该新城商株为弱毒株。     

乌鸡新城疫病毒中发型毒株的分离与鉴定

从发病的43日龄乌鸡群中分离到1株病毒，经鸡胚传代培养后，测定其F3代尿囊液血凝（HA）效价为2^8，HI试验中能被鸡ND阳性血清中和，鸡胚平均死亡时间（MDT）为60．8h，1日龄雏鸡脑内接种指数（ICPI）为0．8，血凝解脱时间小于10min，血凝素热稳定性差。表明该分离株为新城疫病毒中发型毒株。     

鸡新城疫病毒分离鉴定及其部分生物学特性的研究

了解内蒙古乌兰察布市集宁地区鸡新城疫的流行概况,对该地区疑似新城疫病毒(NDV)感染的病料进行分离鉴定.通过接种10日龄SPF鸡胚,结果分离到2株病毒,经血凝试验及新城疫和禽流感阳性血清的血凝抑制试验,证明2个分离株均为新城疫病毒,分别命名为JN1、JN2,并对分离的2个毒株进行MDT、ICPI和IVPI.毒力测定,结果表明,分离株的MDT分别为40.5 h和43.5h,ICPI分别为1.86和1.85,IVPI分别为2.38和2.69.可以判定JN1和JN2病毒株为新城疫病毒强毒株.     

鸡新城疫病毒地方株分离鉴定及部分生物学特性研究

鸡新城疫 (ND)是由鸡新城疫病毒 (NewcastlediseaseVirus,NDV)引起的主要侵害鸡和火鸡的一种高度接触性传染病。主要临床症状是呼吸困难、下痢、精神紊乱、粘膜和浆膜出血 ,是严重危害养禽业的重要疫病之一。由于长期采取普遍的预防接种和综合性防疫措施 ,已大大减少了该病引起的经济损失 ,但该病至今还没有得到根本的控制 ,仍对养鸡业发展构成主要威胁〔1〕。 2 0 0 3年上海市松江地区某鸡场在免疫鸡群中暴发了以严重精神不振、呼吸困难、站立不稳、羽毛蓬松及两足伸展、震颤为主要症状的疾病。根据流行病学调查、临床表现、病理剖检变…     

一株鸡新城疫强毒株的分离及生物学特性鉴定

从河南某鸡场的产蛋下降而无其他典型新城疫症状的高抗体蛋鸡群中分离到一株病毒。经过鉴定,该分离株具有血凝性,可被ND标准阳性血清所抑制和中和,不能被AI(H5与H9亚型)和EDS-76标准阳性血清抑制;该病毒致死鸡胚的平均时间(MDT)为50.4h,1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数(ICPI)为1.85;6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2.42;回归试验鸡出现新城疫症状和病变,对该病毒株F基因部分片段进行了序列测定分析,为强毒型新城疫病毒基因Ⅶ型,并暂命名为HNC-06。     

鸡新城疫病毒东北地区分离株融合蛋白基因的克隆与鉴定

以 Ｎ Ｄ Ｖ 东北地区分离株 Ｄ Ｂ３ 、 Ｄ Ｂ５ 的基因组 Ｒ Ｎ Ａ 为模板, 通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术扩增其 Ｆ 基因的ｃ Ｄ Ｎ Ａ,并将其克隆到质粒ｐ Ｕ Ｃ１９ 中, 转化感受态大肠杆菌 Ｄ Ｈ５α, 经分子量比较、酶切分析、 Ｐ Ｃ Ｒ 等鉴定方法证明, 我们分别获得了含有 Ｎ Ｄ Ｖ Ｄ Ｂ３ 、 Ｄ Ｂ５ 株 Ｆ基因的阳性重组质粒。     

13株新城疫病毒强毒株的分离鉴定及部分生物学特性

2004年-2005年从黑龙江省11个地区鸡场、鸽场、鹅场疑似新城疫(ND)病死鸡、鸽、鹅体内分离到24株具有血凝活性的病毒,经HA、HI试验和电镜观察证实了13株病毒为NDV。其鸡胚平均死亡时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(IC-PI)分别为36.8 h~73.6 h和1.51~2.00之间,属于NDV强毒株或中强毒株。除HLJ-12-04株外,强毒株的血凝素热稳定性较差,属快速或中速血凝解脱型;弱毒株的血凝素热稳定性好,属慢速血凝解脱型。所有毒株均可较好地凝集鸡和人(O型血)的红细胞,但对其他动物的红细胞凝集性差异较大,对马和兔的红细胞凝集无规律。     

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

重组和构建了新城疫病毒融合蛋白基因,并对该基因进行了鉴定。结果显示,将ＮＤＶ Ｆｘ基因片段经ＲＴ－ＰＣＲ扩增,插入经ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切克隆载体ｐＵＣ１８及表达载体转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９株。用氨苄青霉不平板法初步筛选克隆,双酶切法,核酸探针,ＰＣＲ及核苷酸序列分析法鉴定后,表明插入成功且阅读框架正确。     

新城疫病毒山东强毒株的分离鉴定

从山东流行烈性传染病的鸡群中分离出7株具有血凝活性的病毒，该7株病毒的血凝活性均能被新城疫La Sota株标准阳性血清所抑制，但病毒不能被中和，仍能致死鸡胚。经分离鉴定，分离毒均为新成疫病毒株。通过鸡胚半致死量（ELD50）、最小致死量致鸡胚的平均时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内致死指数（ICPI）、6周龄雏鸡静脉致死指数（IVPI）、血凝解脱及血凝素稳定性等试验表明：7株分离病毒均为新城疫病毒强毒性，其毒力与标准强毒株F48E9株相似。