产气荚膜梭菌ε毒素及其疫苗研究进展

产气荚膜梭菌病是由产气荚膜梭菌引起的一种重要的人兽共患传染病,可导致山羊、绵羊等动物的肠毒血症或坏死性肠炎,并且可引起动物脑、心、肺和肾组织的水肿.B型和D 型产气荚膜梭菌所产生的ε毒素是引起动物上述病理变化和死亡的重要因素之一.虽然甲醛灭活的毒素疫苗能对动物产生保护性抗体,但是,灭活苗潜在的安全性原因使其在应用上受到限制.因此,基于ε毒素基因的重组疫苗和弱毒疫苗就成为人们研究的目标.     

D型产气荚膜梭菌ε毒素研究进展

D型产气荚膜梭菌常引起新生羔羊痢疾和山羊、牛等家畜的肠毒血症,致死性强,对畜牧业造成很大的危害.ε毒素是D型产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原,从分子生物学的角度对该毒素的研究具有重要实际意义.论文主要对国内外关于D型产气荚膜梭菌ε毒素分子生物学结构与性质,ε毒素引起的家畜肠毒血症以及对其作用靶器官肾脏和脑组织破坏的致病机理进行了介绍,对国内外D型产气荚膜梭菌ε毒素预防措施进行了综述,为研究D型产气荚膜梭菌ε毒素结构与功能的关系以及预防治疗动物肠毒血症提供参考.     

产气荚膜梭菌ε毒素原核表达及其单克隆抗体的制备

以大肠杆菌表达的D型产气荚膜梭菌点突变的ε毒素蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,经过ELISA方法筛选,获得2株稳定分泌抗ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C3-D7和5H6-B8,单抗均为IgG1型。Western blot鉴定结果显示:2株单抗均能与重组ε毒素蛋白及D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白发生特异性结合。本试验为进一步研究产气荚膜梭菌ε毒素的生物学特性及建立产气荚膜梭菌的快速检测方法提供了基础。     

产气荚膜梭菌ε毒素重组突变体大肠杆菌表达条件的优化

为优化产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的表达条件,以前期构建的产气荚膜梭菌ε毒素重组突变体为基础,通过控制变量法确定诱导温度、诱导时间、IPTG诱导浓度以及诱导时菌液浓度等原核蛋白表达条件.结果表明,ε 毒素的重组突变体在37℃、菌液OD600值为0.895～1.295,1.6 mM IPTG诱导6 h条件下可溶性表达量最高...     

产气荚膜梭菌α毒素研究进展

产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens)α毒素是第一个被赋予酶活性的细菌毒素 ,194 1年Mac Farlane和 Knight将其命名为磷脂酶 C。产气荚膜梭菌是一类革兰氏阳性厌氧粗大杆菌 ,大小 3～4μm× 1～ 1.5μm,分布广泛 ,恶劣时可产生高抵抗力的内生性孢子。该菌产生的外毒素有α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν 12种以及肠毒素 (也称为芽胞相关蛋白 ) ,但主要起作用的是α、β、ε、ι4种。根据细菌产生外毒素的种类差别 ,可将产气荚膜梭菌分成 A、B、C、D、E等 5型。各型菌均可产生α毒素 ,其中以 A型菌产生的最多。毒素…     

腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素的 共表达及其免疫效力评价

为获得腐败梭菌α毒素和D型产气荚膜梭菌ε毒素的共表达产物,并鉴定其致死活性和反应原性,评价其免疫保护效力,利用PCR扩增腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因Gcsa和Gcpe并克隆至pETDuet-1质粒,转化E.coli BL21(DE3),自诱导培养基诱导这2段基因共表达;用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清中和试验对表达产物进行鉴定;将诱导后的大肠杆菌灭活,制成铝佐剂疫苗1 m L/只皮下注射免疫家兔2次,测定免疫血清中和抗体效价,用1 MLD的腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的E.coli BL21(pETDuet-Gcsa-Gcpe)可以同时表达Gcsa和Gcpe,表达产物能够与腐败梭菌和D型产气荚膜抗毒素血清反应;且具有小鼠致死毒性,只有用2种抗毒素一同作用,才能将其毒性中和;制成灭活疫苗免疫家兔,免疫血清对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为2 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价≥50 MLD/0.1 m L;用2种毒素攻击,免疫组家兔全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典》(2015版)效力检验标准。结果表明,所构建的表达载体可以实现α毒素和ε毒素的活性共表达,本研究为腐败梭菌和产气荚膜梭菌的多联基因工程灭活疫苗的研究提供了实验基础。     

产气荚膜梭菌ε毒素基因的克隆、表达及其抗血清的制备

PCR扩增B型产气荚膜梭菌C58-2株ε毒素完整基因,并将其插入到pGEM-TEasy载体中,构建克隆载体pGEM-T-ε。对克隆载体pGEM-T-ε进行双酶切,将得到的918bp片段以正确的阅读框架定向克隆于pET-28a(+)中,然后将重组质粒转化进宿主菌BL21(DE3)中,在37℃1mmol/LIPTG诱导下该基因获得良好表达。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白约为36600,与预期值一致。Western-blotting试验显示,该重组蛋白可被D型产气荚膜梭菌血清识别,表明该重组蛋白具备天然毒素相似的反应原性。重组ε毒素蛋白在菌液上清、超声波裂解上清和包涵体中均有分布,表明重组蛋白可同时以胞外、周质和胞浆的形式表达,且以周质方式为主。重组蛋白在胰酶活化前后均可致死小鼠,活化后毒力可为原来的150倍。以重组ε毒素蛋白作为抗原免疫家兔制备血清,效价测定结果表明,重组ε毒素蛋白抗血清每毫升可中和30000个小鼠MLD。毒素-抗毒素中和试验和琼脂扩散试验均表明,该抗血清具有ε毒素特异性。     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

作者对产气荚膜梭菌α毒素的组成、理化性质、生物学特性、检测、结构功能、作用机理、分子遗传及其与氨基酸的组成和细胞膜之间的关系等方面的研究进展作了简要综述。     

产气荚膜梭菌α毒素研究进展

α毒素是产气荚膜梭菌的主要毒素和致病因子之一。本文综述了产气荚膜梭菌α毒素的检测，基因的克隆，表达和调控以及毒素的结构与功能等方面的研究进展。     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

产气荚膜梭菌 (Clostridiumperfringens)的致病作用一般由它所产生的胞外酶或毒素诱导。主要有α -毒素、β -毒素、θ -毒素及其他的一些胞外酶。本文针对产气荚膜梭菌α毒素的组成、结构、理化性质、作用机理及分子遗传等方面的研究进展作了简要综述。     

抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的研制和部分特性鉴定

小鼠ＳＰ２／０骨髓瘤细胞和用产气荚膜梭菌ε类毒素免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠的脾细胞，以ＰＥＧ为融合剂进行融合，获得分泌抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株１３株，经鉴定，杂交瘤所分泌的单克隆抗体在ＥＬＩＳＡ中均特异地与产气荚膜梭菌ε毒素反应，而不与α和β毒素反应，１３株单克隆抗体均为ＩｇＧ１亚类，经毒素抗毒素中和试验测定，１３株单克隆抗体中，１２株具有中和ε毒素的活性。     

产气荚膜梭菌主要毒素生物学活性研究进展

梳理和总结了产气荚膜梭菌的主要毒素种类、生物学活性、致病机制等,为后续的毒素分型、快速检测方法建立以及相关致病机制研究提供参考。     

产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

为获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,并将第106位组氨酸突变为脯氨酸,经人工合成获得基因片段GETXH106P。将GETXH106P克隆至原核表达载体p ET30a(+),转染BL21(DE3)菌中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白r ETXH106P。利用Western blot方法检测r ETXH106P与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)以及小鼠的毒力。随后,将r ETXH106P与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果表明,r ETXH106P为可溶性表达,通过灰度扫描,其可溶性表达量比例可达30%;该重组蛋白能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;细胞毒性试验结果显示,100μg/m L的重组蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性实验结果显示,6.25×106ng/kg剂量的重组蛋白对小鼠仍无致死性;每毫升的一免抗血清可中和450~700个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和3000~4000个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1 MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。以上结果表明,产气荚膜梭菌r ETXH106P重组蛋白毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。     

产气荚膜梭菌主要致死性毒素的研究进展

产气荚膜梭菌作为危害各国家畜养殖业的主要致病菌之一,受到国内外研究者的普遍关注.产气荚膜梭菌的主要致病因子是菌体产生的外毒素.近年来,国内外对其致病机理进行了深入研究,建立起简便、快速的检测方法,并且在防治手段方面取得了巨大突破.对产气荚膜梭菌的主要致死性毒素类型、致病机理、检测技术及其防治措施等方面的研究进展进行了阐述.     

产气荚膜梭菌β2毒素研究进展

产气荚膜梭菌是引起各种动物坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原菌之一,该菌可以产生15种以上的毒素,α、β、ε、ι毒素、肠毒素及β2毒素等被认为是主要致病性毒素,其中β2毒素被推测在该病致病过程中起着重要作用。近年来,国内外对β2毒素的研究正在逐步深入和完善。论文就产气荚膜梭菌β2毒素的分子结构特征、生物学特征、致病性及免疫原性等方面的研究进展进行论述。     

产气荚膜梭菌主要外毒素最新研究进展

产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病的病原体,可引起人的食物中毒和抗生素相关腹泻.近年来,对产气荚膜梭菌的主要外毒素研究取得了重大进展.本文综述了产气荚膜梭菌主要外毒素的组成、结构、理化性质、作用机理、检测及分子遗传学等方面的研究进展.     

D型产气荚膜梭菌主要毒素基因的PCR检测

为了研究产气荚膜梭菌主要毒素基因,试验采用生物软件以NCBI上登录的产气荚膜梭菌α毒素、ε毒素作为参考,设计扩增D型产气荚膜梭菌α毒素与ε毒素的特异性引物,预期基因片段大小分别为1 110 bp、888 bp,进行PCR扩增。结果表明:设计的引物可以良好地扩增α毒素基因与ε毒素基因,基因片段大小与预期一致。     

产气荚膜梭菌肠毒素的致病机理研究进展

产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病的病原体，可引起人的食物中毒和抗生素相关腹泻，产气荚膜梭菌肠毒素是该菌的一个非常重要的致病毒素，在引起人的胃肠疾病方面起着关键性的作用，本文对产气荚膜梭菌肠毒素产生、细胞毒性和组织学作用以及在胃肠粘膜上造成损伤的致病分子机理等方面的研究内容进行论述。     

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906 bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54 ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。     

G型产气荚膜梭菌NetB毒素研究进展

G型产气荚膜梭菌可引起鸡坏死性肠炎和肠毒血症,致病力强,在自然界中广泛存在,严重危害养鸡业的发展。坏死性肠炎B样毒素(necrotic enteritis B-like toxin, NetB)是近年来发现的是一种新的β-成孔毒素(β-pore-forming toxin,β-PFT),是G型产气荚膜梭菌的主要致病性毒素和保护性抗原,深入研究该毒素的结构功能及致病机理对于鸡坏死性肠炎的防控具有重要意义,但至今尚无相关系统性综述报道。鉴于此,论文主要对国内外关于G型产气荚膜梭菌的流行概况、NetB毒素的分子结构特征、生物学特性、致病机理及其相关防治制剂等方面的研究进行综述,为进一步基于NetB毒素研制鸡坏死性肠炎的防治制剂提供参考。