新城疫病毒核酸检测标准物质研究

分别设计了3对引物,从灭活新城疫病毒F48E9株和Lasota疫苗株病毒提取的RNA中扩增了完整的M、FA和HN基因编码序列,并克隆于pGEM-T.经测序确认后,采用体外转录方法制备了6种RNA纯品.初步定量后,用RNA保存液稀释至含量约108拷贝数/mL,分装.分装后均一性检测结果显示瓶间差异<5%,稳定性实验表明室温20~25℃(相对湿度20%~50%)14天稳定;长期监测结果表明:2~8℃6个月及-20℃保存1年的含量均无明显变化.委托多家实验室采用外标实时荧光定量RT-PCR检测方法对制备的标准物质进行准确定值.以上结果表明该制备物可以作为新城疫病毒的核酸检测标准物质.     

猪瘟病毒C株检测用国家核酸标准物质的研制

为研制均匀、稳定的猪瘟病毒（CSFV）核酸标准物质,选择CSFV C株接种于PK-15细胞并收获病毒液,然后经过病毒灭活、分装、冻干,最终形成核酸标准物质。用微滴式数字PCR对制备的CSFV标准物质进行均匀性和稳定性评估、标准物质合作定值,在评定不确定度后计算得出最终量值结果,并开展临床试用。结果显示,该标准物质均匀,4 ℃条件下可稳定存放4周,25 ℃可稳定存放1周,-20 ℃可稳定存放11个月,量值结果为（5.1±0.7）×105 copies/mg;临床试用显示,所制备的标准物质与临床样本的互通性良好。本研究制备的CSFV C株国家核酸标准物质均一性良好、稳定、量值准确度高,并通过了全国标准物质管理委员会评定,可用于动物及动物产品质量安全检测,从而有效保障猪瘟防治工作的开展。     

用核酸探针检测新城疫病毒的研究

用光敏生物素标记鸡新城疫ｃＤＮＡ制备核酸探针，经斑点杂交和碱性磷酸酶显色后，探针同该ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物，ＰＣＲ产物重组子和新城疫强，弱毒株呈现阳性反应，与ＩＢＶ，ＩＬＴ，ＭＧ和正常尿囊液等均呈阴性杂交反应，田间病料的杂交试验也表明该ｃＤＮＡ探针是且特异的检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株国家核酸标准物质的研制

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株国家核酸标准物质,将PRRSV欧洲株代表毒株LV接种Marc145细胞,待出现细胞病变后,反复冻融收集病毒液,并灭活分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、数字PCR法定值、不确定度分析和临床试用。结果显示,制备的标准物质的定值为(1.83±0.22)×10~4 copies/μL;样品均匀;-20℃稳定保存12个月以上,4℃稳定2个月以上。经全国标准物质管理委员会的专家评审,该制备物达到了国家二级标准物质的要求,可以作为核酸扩增检测的PRRSV核酸标准物质。     

新城疫病毒LaSota疫苗株的蚀斑纯化

通过蚀斑克隆技术,对新城疫病毒LaSota疫苗株进行连续纯化,在原病毒株的基础上筛选到1株免疫原性较好的病毒纯化株,血凝效价从9 log2提高到11 log2,鸡胚半数感染量(E ID50)从10-9.1/0.1 mL上升到10-9.5/0.1 mL。通过对纯化株的F基因和HN基因进行测序,并与GenBank中已发表的新城疫病毒LaSota株基因序列进行比较发现,F和HN基因核苷酸序列的同源性分别在99.5%和98.6%,氨基酸同源性分别为99.1%和96.9%;F基因裂解位点区(112~117)氨基酸组成与原疫苗株完全一致。纯化株的鸡胚平均死亡时间(MDT)在109 h、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为0.375,与原疫苗株进行生物学特性比较,表明该纯化株比原疫苗株更适合用于疫苗生产。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸检测标准物质的制备研究

针对目前口蹄疫病毒核酸扩增检测缺乏标准物质的现状,以口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型核酸为模板,分别设计引物扩增具有检测意义的5′端1nt～2208nt的片段(含完整的5′NCR)和3012nt～5155nt片段(含完整1D～2B区域),并克隆于pMD20-T。测序后采用体外转录方法制备2种RNA纯品,进行初步定量稀释后等量混合分装。采用荧光定量RT-PCR方法进行均匀性和稳定性检验后,委托外部实验室对RNA片段进行拷贝数定值。结果显示,制备的标准品均匀性和稳定性良好。     

应用逆转录套式PCR检测新城疫病毒核酸

选择DNV融合蛋白保守的编码区域,设计并合成了一对外引物和一对内引物,建立并优化了检测新城疫病毒核酸的逆转录套式PCRI地,通过检测NDV感染的实验客观存在病料和临床病料,结果表明,逆转录套式PCR法最低能鉴别出约0.3pg的NDV RNA,攻毒后第8天还能从非免疫鸡和SPF鸡泄殖腔拭子中检出DNV,第8天非免疫鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为5/10,第8天SPF鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为6/10,对非免疫鸡和SPF鸡的泄殖腔中NDV最佳检出时间均在攻毒后第5天。逆转录套式PCRY应运地临床样品中DNV的最大检出率为6/7,经核酸杂交验证,该法具有很高的特异性和敏感性,也比较简便快速,为从分子水平探讨NDV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒国家核酸标准物质的研制

为了研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)国家核酸标准物质,将PRRSV美洲变异株代表毒株PRRSV JXA1接种Marc145细胞,出现细胞病变后,反复冻融并收集病毒液,并灭活分装。制备后进行均匀性、稳定性评估、数字PCR法定值、不确定度分析和临床试用。结果表明,制备的标准物质的定值为:(1.13±0.18)×10~4拷贝/μL,样品均匀;-20℃可稳定保存12个月以上、4℃可稳定2个月以上。经全国标准物质管理委员会的专家评审,该制备物达到了国家二级标准物质要求,可以作为核酸扩增检测PRRVS的核酸标准物质。     

以4单位病毒为标准物质定量新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒的最低检出量

本实验首次以4单位病毒为标准物质,定量新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒的最低检出量,用新城疫病毒La Sota株接种SPF鸡胚,制备尿囊液,经血凝试验测定滴度为27;将尿囊液倍比稀释后,提取各稀释度样品核酸,用新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒进行扩增,结果多数样品均可检出特定长度的核酸。用该尿囊液制备4单位病毒为标准物质,倍比稀释后,提取各稀释度病毒核酸,对新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒的最低检出量进行定量,结果表明该试剂盒的最低检出量为4单位病毒的1:32倍。该方法对于新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒等分子生物学诊断试剂的研发、生产、质量控制和比对具有参考意义。     

新城疫病毒LaSota株在鸡胚中的繁殖动态

用新城疫病毒（ＮＤＶ）ＬａＳｏｔａ株尿囊腔接种１０日龄非免疫鸡胚，以血凝（ＨＡ）试验检测接种后２４、４８、７２、９６，１２０、１４４和１６８小时所收集的鸡胚液（尿囊液和羊水）、胚体、尿囊膜的ＨＡ价。结果表明，在上述时间内，胚体、尿囊膜的含毒量很低，无收获价值；病毒在鸡胚液中自接种后２４小时繁殖呈线性上升，至１２０小时，胚液中含毒量最高，以后则下降，故此时是收获的最佳时间。     

核酸标准物质研究现状

以核酸扩增为基础的分子诊断技术越来越广泛的应用于医学研究、出入境检验检疫、疫病诊断等领域,核酸标准物质是保证体外诊断检测数据和结果准确一致的重要材料。作者介绍了国内外核酸标准物质的发展历史、研究现状及面临的挑战,展望了核酸标准物质未来发展方向。     

狂犬病病毒LN34基因假病毒核酸国家标准物质的研制

LN34基因作为狂犬病病毒核酸诊断的首选基因已被广泛应用,但检测活动中涉及生物安全要求以及缺少相应的核酸标准物质,导致很难对现有核酸诊断方法进行有效评价。本研究以慢病毒为表达载体,制备了含有狂犬病病毒LN34基因的假病毒核酸标准物质,并对该标准物质开展了均匀性、稳定性评估以及数字PCR法定值、不确定度分析和临床试用。结果显示：制备的标准物质定值为(1.33±0.23)×10⁴拷贝/μL,样品均匀;-20℃条件下可稳定保存6个月,4℃可稳定保存9 d,25℃可稳定保存1 d。本标准物质的研制为相关实验室开展量值溯源、能力验证、质量控制、方法评价、试剂选择等工作提供了技术支撑。     

低血凝价新城疫LaSota株病毒免疫原性的研究

用血凝价分别为0、7、8的三批新城疫LaSota株病毒制备的油乳剂疫苗免疫60日龄蛋鸡,疫苗免疫10d后HI抗体水平平均值分别为3.9Log2、5.2Log2、5.9Log2,免疫后20dHI抗体水平升到高峰(4.0Log2、8.1Log2、7.9Log2),免疫60d后用剂量为100ELD50的同种毒攻击。结果表明,血凝价为0的新城疫LaSota株病毒抗原制备的油乳剂免疫效果较差,不能抵御病毒的攻击,但血凝价为7和8的两批病毒抗原能抵御病毒的攻击,并与血凝价为9的病毒抗原的免疫原性无显著差异。     

病毒性神经坏死病病毒核酸检测用标准物质的制备

利用基因克隆和体外转录技术,制备病毒性神经坏死病病毒(Nervous necrosis virus,NNV)核酸检测标准物质。设计NNV RNA2基因的特异性引物,通过RT-PCR获得目的片段并连接至p GEM-T载体;采用体外转录方法,获得大量纯品RNA。初步定量稀释至约10~8 copies/μL,均匀性检验结果显示样品间差异5%;稳定性检验表明,室温(20~25℃)保存7 d、冷藏(2~8℃)保存1个月和冷冻(-20℃)保存6个月的含量均无明显变化。采用核酸浓度测定与拷贝数换算的方法,对转录的RNA片段进行定值,并根据委托单位的定值结果进行不确定度估算。核酸标准物质定值为(8.452±0.068)×10~8 copies/μL,可用作NNV核酸检测的标准质控品。     

新城疫热稳定性天然弱毒B95株核酸疫苗的构建

将含有新城疫热稳定性天然弱毒B95株F基因的重组克隆质粒pGEM—F用Not Ⅰ单酶切，电泳回收纯化目的片段，与同样用NotⅠ单酶切并经去磷酸化处理的真核表达载体pcDNA3．1连接，构建了新城疫核酸疫苗，并用所构建的新城疫核酸疫苗与载基因阳离子脂质体结合进行了免疫试验，通过ELISA、淋巴细胞转化试验检测了核酸疫苗在鸡体内的表达。结果显示，表达产物作为抗原物质刺激机体产生了特异性应答反应，引起了机体特异性的体液免疫和细胞免疫，对新城疫强毒攻击的保护率为75%。     

插入BC株V蛋白的重组新城疫病毒(LaSota株)毒力鉴定及对先天性免疫的影响

为探究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的V蛋白拮抗宿主干扰素(interferon,IFN)信号通路对先天性免疫的影响,本试验测定了低毒力LaSota株插入BC株V蛋白的重组病毒rL-BC的毒力和感染后4,8,12 h的感染效率,病毒感染后上清的IFN-β生成情况和P-STAT1、M...     

猪圆环病毒1型和2型核酸定性标准样品的研制

为了研制猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)核酸定性标准样品,分别将PCV1和PCV2病毒全序列克隆至pMD18-T载体中并进行稀释分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、定值和临床试用。结果:制备的标准样品的参考值分别为:1.33×10⁴ copies/μL(PCV1)和1.11×10⁴ copies/μL(PCV2);样品均匀;-20℃可稳定保存24个月以上,4℃可稳定2个月以上。经国家标准化管理委员会组织的专家评审,达到了国家标准样品的要求,可作为核酸扩增检测的猪圆环病毒核酸标准样品。     

新城疫病毒SXFP株的分离鉴定

从陕西富平某种鸡场发病鸡群中分离出一株流行毒株,经HA—HI试验和动物回归试验,确定分离到的病毒为鸡新城疫病毒（NDV）,命名为SXFP株。经过测定。SXFP株鸡胚半数致死量（ELD50）为10^9.0／0．1mL;鸡胚最小致死量的平均致死时间（MDT）为52．3h,对1日龄SPF雏鸡脑内致病指数（ICPI）为1．92,提示SXFP株为强毒株。血清HI交叉反应试验显示SXFP株和La Sota株存在较小的抗原性差异。     

用"新城疫核酸疫苗"紧急治疗的效果

江苏省东台市富东镇养鸡户崔某饲养了伊莎褐商品代蛋鸡1850羽。至2003年3月1日(已有33日龄)全群出现比较明显的发病状态和零星死亡。经笔者询问得悉,该批蛋鸡在13日龄时进行过一次群体IV系苗饮水免疫(作者注:只有经过个体免疫后的鸡群,才允许群体免疫),因疫苗水配制得太少,半小时不到就饮用完。由此可见,相当部分的雏鸡未曾饮得上疫苗水,故为日后新城疫发病带来颇大隐患。1临床症状病鸡咳嗽,呼吸时发出“咕噜”声,精神萎靡,只喜欢饮水,很少看见雏鸡采食,基本上都厌食,全身呈无力状,常常是蹲卧在育雏架硬网上,行走迟缓并出现东倒西歪,羽毛蓬…