鸭星状病毒3型RT-RAA快速检测方法的建立

鸭星状病毒是近年来危害我国鸭业发展的新发病原之一,给养鸭业造成了较大的经济损失,其中鸭星状病毒3型(DAstV-3)是近年来感染率较高的星状病毒。为实现DAstV-3的快速检测,根据DAstV-3的RNA依赖性核糖核酸聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)设计特异性探针与引物,建立了DAstV-3的荧光RT-RAA检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性和临床适用性进行了评估。结果显示:建立的RT-RAA方法能够在39℃恒温条件下,在20 min内实现对DAstV-3的快速检测,与H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、鹅星状病毒、禽呼肠孤病毒等常见病毒均无交叉反应,最低检测限为10¹ copies/μL;临床样本检测发现RT-RAA方法阳性检出率高于常规RT-PCR方法,且检测时间较RT-PCR更短。结果表明,本研究建立的RT-RAA方法灵敏度高,特异性强,操作简便,临床适用性好,适合DAstV-3的现场快速检测。     

鲤春病毒血症病毒RT-RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种可现场快速准确检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法，本研究结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术，根据SVCV L基因保守区域设计引物及探针，通过优化反应时间和温度等条件，初步建立了可用于SVCV现场可视化检测的RT-RAA-LFD方法。优化后的检测方法在35℃水浴锅中恒温反应15 min即可实现对SVCV目的基因片段的有效扩增。结果显示，该方法可以特异性的检测SVCV，并且不与病毒性出血败血症病毒、传染性鲑鱼贫血症病毒、病毒性神经坏死病毒等其他常见鱼类病毒发生交叉反应；对SVCV重组质粒标准品的检测限为2.42×10²拷贝/μL，并具有较好的稳定性和重复性；采用该方法和病毒分离、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、荧光定量RT-RAA共5种方法同时对45份临床样品检测，其中病毒分离、套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR均检测到29份阳性样品，荧光定量RT-RAA和本研究建立的方法均检测到28份阳性样品，本研究与前3种方法的阳性符合率为97.8%，与荧光定量RT-RAA的阳性符合率为100%。上述结果表明，本研究建立的SVCV ...     

猫传染性腹膜炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为快速、灵敏、准确检测猫传染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus,FIPV）,以FIPV N基因为靶序列设计合成特异性引物及TaqMan探针,建立了一种FIPV实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了试验。结果表明：该方法灵敏度高,最低检测限为3.4 copies/μL;特异性强,与狂犬病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫细小病毒、犬流感病毒、犬瘟热病毒等均无交叉反应;重复性好,批内变异系数为0.99%~4.13%,批间变异系数为1.29%~4.64%。以上结果说明,本试验建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异、敏感、重复性好,适用于FIPV的快速检测。     

一例猫冠状病毒感染的诊治

正猫冠状病毒(Feline coronavirus,FCoV)属于冠状病毒科,冠状病毒属,是1种有囊膜的RNA病毒,基因组由29 190个核苷酸组成[1]。FCoV有2种已知的生物型,即猫传染性腹膜炎病毒和猫肠道冠状病毒。FCoV主要经消化道感染或媒介昆虫传播,在全世界广泛流行,据对全世界的家猫统计,家庭饲养的猫有25%～40%为冠状病毒阳性,大型养殖场阳性率达到80%以上[2]。许多猫感染后没有临床症状,但是可能会继发死亡率极高的猫传染     

猪德尔塔冠状病毒荧光RT-RAA快速检测方法的建立及初步应用

近年来,猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)给养猪业造成了较大经济损失。为快速检测PDCoV,针对病毒N基因设计特异引物,建立了PDCoV重组酶介导核酸等温扩增荧光法(RT-RAA)。通过优化引物浓度、反应温度,确定了最佳反应条件,然后进行了特异性和灵敏性试验,并与普通RT-PCR方法进行了比较。结果显示:该方法特异性较好,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪捷申病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒等猪源病毒无明显交叉反应;反应过程均在39℃恒温条件下完成,用时30 min即可得到扩增结果 ;反应体系可检测的最低扩增拷贝数为10 copies/μL,敏感性较高;该方法检测68份猪源病毒样品的PDCoV阳性检出率为17.6%,高于普通RTPCR(13.2%)。结果表明,本研究建立的RT-RAA快速检测PDCoV方法具有快速、特异、灵敏的优点,可用于PDCoV的快速检测和流行病学监测。     

基于RT-RAA的禽流感H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法的建立

采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统，建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5亚型核酸检测新方法。通过分析342条禽流感病毒H5亚型的HA基因序列，选取保守性区域设计具有强特异性的CRISPR RNA(crRNA)序列以及RT-RAA引物，并对检测体系中的主要成分LwaCas13a蛋白、crRNA、TaqMan探针、T7 RNA Polymerase、NTP Buffer Mix含量进行优化，建立了基于RT-RAA的AIV H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法。取10⁵～1 copies·μL^-1含有目的基因的质粒标准品和其他亚型禽流感病毒以及其他禽病病毒分别验证和评价该方法的灵敏性和特异性。结果表明，本文设计的RT-RAA引物与crRNA特异且灵敏，其最佳反应体系中主要成分用量分别为LwaCas13a蛋白(60μg·mL^-1)2.0μL、crRNA(100μmol·L^-1)3.2μL、TaqMan...     

北京市1株猫传染性腹膜炎病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为掌握北京市猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)与国内外毒株基因型之间的差异性,无菌采集北京市宠物医院4例疑似患有猫传染性腹膜炎病例的腹水和组织等病料样本,将经RT-PCR诊断为猫冠状病毒(FCoV)阳性的病料样本接种于猫肾细胞(CRFK)进行连续传代培养,结果分离到1株毒株.对分离毒株进行形态学观察,RT-PCR检测,TC...     

猪圆环病毒2型实时荧光RAA检测方法的建立及初步应用

根据猪圆环病毒2型(PCV2)Rep基因序列，设计引物及探针，建立了PCV2实时荧光重组酶介导等温扩增(recombinase-aid amplification, RAA)检测方法。该方法能在40℃恒温条件下20 min内对病原进行快速检测，与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒3型和口蹄疫病毒均无交叉反应；对病毒核酸的最低检测限为21.2 copies/μL。用荧光PCR检测方法与建立的荧光RAA检测方法对66份临床样品进行检测，两种方法符合率为90.09%。结果表明，建立的PCV2实时荧光RAA方法适用于PCV2的快速检测。     

猫传染性腹膜炎诊断研究进展

猫传染性腹膜炎(FIP)是由猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)引起的全身性、致死性疾病.FIPV属于猫冠状病毒(FCoV),主要感染单核细胞,具有很强的致病性.另一种非致病性冠状病毒,称为猫肠道冠状病毒(FECV),存在于大多数健康猫肠道内.根据血清学和基因序列,可以将FCoV分为Ⅰ型和Ⅱ型,FECV和FIPV在基因组上有...     

检测猫杯状病毒RT-qPCR方法的优化与应用

为建立一种通用性良好的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank上猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV) ORF1保守区域序列,设计合成1对特异性引物,用于FCV的快速检测。灵敏性试验结果显示,该方法的检测下限为4.93×10¹拷贝/μL,比普通RT-PCR检测下限高100倍;特异性试验结果显示,该检测方法与猫疱疹病毒、猫细小病毒、猫传染性腹膜炎病毒等无交叉反应;通用性试验结果显示,针对引物靶位点区间,该方法对所有已知变异位点的人工合成质粒和本实验室保存的不同变异位点的FCV毒株,均能够良好检出;重复性试验结果显示,组内的变异系数为0.09%～0.71%,组间变异系数为0.05%～0.82%,均小于1%。对23份临床样品进行检测,该方法的阳性检出率为60.9%,检出的14份阳性病料分别接种到CRFK细胞中,对细胞病变产物进行扩增并测序,BLAST对比后结果证实为FCV毒株。结果表明,本试验建立的荧光定量RT-PCR检测方法可用于FCV的快速诊断及流行病学的调查。     

猫冠状病毒感染及其诊断方法的研究进展

猫冠状病毒(FCoV)感染在全世界广泛流行。从没有临床症状的隐性感染到具有高度致命性的猫传染性腹膜炎(FIP),FCoV感染可以引起不同的症状。FIP是猫最严重的病毒性疾病之一,不仅致死率非常高,而且诊断和预防也非常困难。目前,对FIP既无有效的疫苗预防,也无有效的药物治疗。因此,对于FCoV的管理与控制,准确的诊断是至关重要的。本文系根据国外的有关资料编译,主要介绍了FCoV感染和FIP,特别是比较详细的介绍了FCoV感染的诊断方法,可供养猫者及相关人员参考。     

猫等孢球虫荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、准确检测猫等孢球虫的方法，本研究采用GenBank登录的猫等孢球虫18s r RNA基因序列(L76471.1)保守区设计并合成1对特异引物，从经显微镜检测为猫等孢球虫阳性的粪便样品中选取一份提取猫等孢球虫DNA，以其为模板经PCR扩增猫等孢球虫18s r RNA基因片段，构建重组质粒标准品p UCm-T-IF1并经PCR及测序鉴定正确后作为质粒标准品。通过优化反应条件，建立了猫等孢球虫的荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示，该方法可以特异性的检测猫等孢球虫DNA，对猫贾第虫、猫滴虫、猫细小病毒、猫冠状病毒DNA/cDNA的检测结果均为阴性；对重组质粒标准品的检测限可达6.26×102拷贝/μL。批内和批间重复性试验的变异系数分别是0.61%～2.06%和0.32%～0.50%。表明本研究建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好。利用该方法对23份临床疑似猫等孢球虫感染的样品进行检测，荧光定量PCR的检出率为78.26%(18/23)，明显高于漂浮法检测的阳性率43.48%(10/23)，并且经漂浮法检测为阳性的样品采用该方法检测均为阳性。结果表明，本研究建立的荧光...     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立与初步应用

建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测。根据猫疱疹病毒Ⅰ型的gI基因序列设计了一对特异性引物,以疑似猫疱疹病毒Ⅰ型感染猫的眼鼻分泌物总DNA为模板,建立了PCR检测方法,对所建立的方法进行特异性、敏感性和重复性验证,并对26份临床样本进行检测。结果表明,所建立的PCR诊断方法与犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、绵羊肺炎支原体(M.ovis)、牛支原体(M.bovis)、牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)均无交叉性反应,最低检测DNA模板浓度为3.23×10~3 copies/μL。对26份临床病例进行检测,阳性率61.54%。说明建立的FHV-1PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、方便快捷等优点,适合于临床FHV-1感染的快速检测。     

水疱性口炎病毒荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立与应用

本研究建立荧光定量RT-PCR鉴别检测水疱性口炎病毒的方法。针对Gen Bank登录的水疱性口炎两血清型-新泽西型(VSV-NJ)和印第安纳型(VSV-IND)的L基因保守区,设计1对引物和2条探针。通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测VSV的方法。与常规RT-PCR试验比较表明,所建立的荧光RT-PCR检测技术快速、敏感,检测时限3 h以内,具有很好的特异性和重复性,可以实现水疱性口炎病毒的快速检测分型。通过对342份临床样品进行检测,结果表明,所建立的检测方法适用于样品中水疱性口炎病毒的直接检测。     

猪传染性胃肠炎病毒与猪呼吸道冠状病毒荧光RT-PCR鉴别检测方法建立与应用

本研究根据Genbank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和S基因保守区序列设计合成了两对引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测TGEV的方法。该方法能有效地鉴别序列密切相关的猪传染性胃肠炎病毒与呼吸道冠状病毒。与常规RT-PCR试验比较表明,所建立的荧光RT-PCR检测技术快速、敏感,检测时限3个小时以内,具有很好的特异性和重复性。通过对39份临床样品进行检测,结果表明所建立的检测方法直接检测样品中猪传染性胃肠炎病毒。     

小反刍兽疫病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法的建立

为建立小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)可视化快速检测方法,本研究根据PPRV N基因的保守序列设计、合成和筛选出反转录重组聚合酶介导恒温扩增(RT-RAA)特异性引物和CRISPR/Cas12a特异性crRNA。结合侧向流试纸,本研究建立了一种PPRV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法,并对该方法的性能进行了评估。结果显示,该方法特异性良好,与蓝舌病毒(BTV)、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、羊痘病毒(CaPV)、猪水泡病病毒(SVDV)、伪狂犬病毒(PRV)等病毒核酸无交叉反应;敏感性高,最低可检出4.30×10¹拷贝/μL的PPRV核酸;应用该方法及国家标准推荐的RT-qPCR方法对60个模拟样品进行平行检测,结果显示Kappa值为0.918,表明两者具有高度一致性。综上表明,本研究建立的PPRV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法特异性好、敏感性高,且操作简单、无需特殊仪器,可应用于野外或基层农场的PPRV快速筛查检测工作...     

伪狂犬病病毒实时荧光PCR的建立和应用

伪狂犬病是世界范围内严重影响养猪业发展的重要动物疫病,快速检测是有效防控该病的重要措施之一。为了建立该病的快速分子生物学检测方法,根据GenBank中登录的伪狂犬病病毒gD基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测伪狂犬病病毒的实时荧光PCR方法。特异性试验结果表明,该检测方法只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.42pg/μL的总DNA,与PCR方法的灵敏度对比试验表明,其敏感度比PCR至少高10倍。对同一样品进行重复性检测,在组内及组间检测的荧光扩增曲线基本重叠,证实其重复性好。对180份临床样品进行伪狂犬病病毒核酸检测,结果发现有52份阳性样品。结果表明,所建立的实时荧光PCR方法可对伪狂犬病病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点,是开展伪狂犬病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。