应用三重PCR快速同步检测和区分3种马疱疹病毒

马疱疹病毒(equine herpesviruses,EHV)主要有5个型:EHV-1/2/3/4/5,广泛分布于世界马群,其中危害最严重的有EHV-1/2/4,其中EHV-1是马呼吸道疾病、病毒性流产的主要病因,EHV-2与马的上呼吸道感染、结膜炎等有关,EHV-4主要引起急性呼吸道感染[1~5]。EHV在原发性感染后,病毒可在动     

马鼻肺炎的流行及综合诊治

马鼻肺炎（ER）是由马疱疹病毒引起的马属动物传染病。由2个亲缘密切疱疹病毒,即马疱疹病毒l型（EHV-1）和马疱疹病毒4型（EHV-4）引起。EHV-1又称马流产病毒,EHV-4又称呼吸道感染病毒。 1 病原马病毒性流产的病原为马疱疹病毒1型（EHV-1）,马呼吸道感染病毒（又称马鼻肺炎病毒）为马疱疹病毒4型（EHV-4）,属疱疹病毒科甲疱疹病毒亚科的成员。     

山东、河南、河北驴群马动脉炎病毒和马疱疹病毒8型的检测与分析

为了解我国山东省、河南省、河北省驴群中马动脉炎病毒(EAV)和马疱疹病毒8型(EHV-8)的感染现状,于2020年从3个省份的屠宰场和驴场收集驴血样品共计860份.通过RT-PCR和PCR方法分别对血样进行EAV和EHV-8检测,统计其阳性率和混合感染率,并分析其流行情况;同时,对3个省份EAV和EHV-8阳性样品的O...     

黔金荞麦1号转录组测序及生物信息学分析

为了探究黔金荞麦1号种质资源遗传背景、挖掘基因表达和群体遗传学信息,试验采用Illumina HiSeq~(TM)2500高通量测序技术平台对黔金荞麦1号进行转录组测序,并结合生物信息学对转录组数据进行分析。结果表明:测序质控共得到39 954 078条校正数据(clean reads),包含了5.7 Gb碱基序列信息。对clean reads组装聚类去冗余,获得40 919个单基因簇(Unigene),预测出36 741个编码区序列(Coding sequence,CDS)。将Unigene与9大数据库进行比对注释、基因功能及代谢通路分析,共有33 486(81.83%)条Unigene得到注释;13 856条Unigene注释到KOG数据库的25个分类中,其中参与翻译修饰、一般功能及信号传导方面相关注释基因最多;KEGG通路分析共有2 854条Unigene注释到23条代谢通路,其中参与代谢通路、信号传导的注释基因最多。基因结构分析共检测到16 152个单核苷酸突变(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点、1 243个插入缺失标记(insertion-deletion,InDels)及1 419条Unigene含有短片段重复序列(Simple sequence repeat,SSR)位点,其中SSR以三核苷酸重复基元类型最多(983个),占69.27%,以GCC/GGC为主要优势重复序列。说明黔金荞麦1号具有较强的代谢活动和遗传信息处理及修饰能力,并存在丰富的基因结构多样性,可为后期进一步研究其代谢途径、分子遗传标记和基因工程提供基础数据。     

马鼻肺炎病毒主要糖蛋白及其功能

马鼻肺炎(ER)是由亲缘关系密切的马疱疹病毒1型和马疱疹病毒4型(EHV-1/4)引起的马属动物几种高度接触传染性疾病的总称.其基因组包含约80个开放性阅读框,至少编码78种蛋白.目前发现EHV-1至少有12种糖蛋白,其中5个糖蛋白(gB、D、H、L、K)是病毒复制所必需的,另6个糖蛋白(gC、E、G、I、M、gp300)不是病毒在细胞培养物上生长所必需的,但存在于高毒力的野毒分离株.gB、C、D是重要的免疫原性抗原具有病毒中和表位,gM的功能是使病毒穿入和细胞间传播.论文就其中9种糖蛋白及其功能进行介绍,并对其应用前景进行了展望.     

马疱疹病毒1型QuantStudio~(TM)3D数字PCR检测方法的建立

试验旨在建立一种高灵敏性的马疱疹病毒1(EHV-1) 3D数字PCR(3D-dPCR)检测方法,对EHV-1病毒含量较低的样品能准确定量检出,实现马鼻肺炎早期诊断及预防。根据EHV-1糖蛋白B基因保守区域设计特异性引物和探针,优化3D-dPCR反应体系中引物探针浓度和退火温度,对该方法进行灵敏性、特异性、重复性分析,建立了EHV-1的3D-dPCR方法。本研究建立的3D-dPCR方法,引物和探针最佳浓度分别为0.4和0.4μmol/L,最佳退火温度为60℃,该方法绝对定量曲线的R~2=0.998,线性关系良好,与实时荧光定量PCR方法相比灵敏度高10倍左右,最低检出限为5.83拷贝/μL;批内和批间重复性试验变异系数均3.2%;与EHV-4、马泰勒虫、马病毒性动脉炎的核酸无交叉反应;通过对123份临床样品进行3D-dPCR检测,结果显示,3D-dPCR方法阳性检出率为66.7%,高于世界动物卫生组织(OIE)中EHV-1的实时荧光定量PCR方法阳性检出率64.2%。3D-dPCR方法对病毒含量较高的样品与实时荧光定量PCR结果一致,对病毒含量较低的样品敏感性更高,能有效检出可疑样品。本试验结果表明,建立的3D-dPCR方法检测低拷贝数的临床样品时灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于EHV-1的准确定量检测。     

EHV-1-XJ2015株在不同细胞系中增殖规律研究

为了研究马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus 1,EHV-1)在不同细胞系中的增殖规律,试验将该病毒分别接种至Vero细胞、BHK-21细胞和MDBK细胞中进行连续传代培养,观察细胞病变(CPE)情况;对第3代收获的病毒gE基因进行PCR检测及同源性比对;按照Reed-Meunch方法分别测量3种细胞7个时间点的TCID_(50),并绘制一步生长曲线。结果表明:EHV-1对3种细胞有很好的亲嗜性,产生明显CPE;3种细胞都扩增出大小为438 bp的片段,与所选的参考株同源性在99.99%以上;EHV-1在感染3种细胞后0～12 h进入静止期,12～48 h进入快速增长期;感染BHK-21细胞后在36小时时达到最高病毒毒价,TCID_(50)为1×10~(-8.40)/0.1 mL,感染MDBK细胞及Vero细胞后在48小时时达到最高病毒毒价,TCID_(50)分别为1×10~(-7.35)/0.1 mL和1×10~(-5.80)/0.1 mL。说明BHK-21细胞适合作为EHV-1-XJ2015株体外研究的细胞系。     

宁夏部分地区野鸟携带病毒的宏基因组分析

为了解宁夏野鸟携带病毒的自然本底和多样性,发现潜在感染人或畜禽的病毒,本研究利用病毒宏基因组学技术对在宁夏石嘴山市、中宁市和青铜峡市采集的14种119只野鸟粪便样品进行了分析。提取全部样品核酸,经随机引物扩增后进行Illumina高通量测序,利用SOAPdenove软件将获得的32 385 000个读长(reads)拼接成163 192个重叠序列(Contig),再与NCBI病毒数据库中的序列进行比对,分析样本中病毒的种类及丰度。通过序列注释分析显示,0.4%重叠序列与病毒相关,能够进一步注释到19个病毒科,其中63%的病毒序列为噬菌体,33%的为脊椎动物病毒,3%的为昆虫病毒,1%的为植物病毒,在注释到的脊椎动物病毒中包含有禽流感病毒、札幌病毒等人畜共患性病毒。本研究结果丰富了野鸟携带病毒的基础数据资源,同时提示宁夏地区野鸟存在传播一些重要人兽共患病的潜在风险。     

马疱疹病毒8型荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

马疱疹病毒8型(EHV-8)是近年来在规模化养驴场发现的一种病毒,其主要导致马属动物呼吸困难、繁殖障碍(流产、产弱驹等),严重危害养驴业的健康发展。为建立EHV-8的分子生物学检测方法,用于该病原感染的流行病学调查和致病机制研究,根据NCBI数据库中EHV-8参考毒株ORF70基因序列的高度保守区域,设计特异性引物,优化程序,建立检测EHV-8的荧光定量PCR方法。结果表明,该方法灵敏度高,最小检测浓度为100拷贝/μL,灵敏度是常规PCR的100倍;特异性强,与EHV-1、EHV-4均无交叉反应;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.15%～0.83%和0.06%～0.47%。利用新建立的方法对120份临床驴血样本进行检测,阳性检出率为32.5%,研究结果为EHV-8的检测和致病性研究提供了可靠的技术支撑。     

沙鞭全长转录组测序及生物信息学分析

为了明晰沙鞭(Psammochloa villosa)的转录组特征，本研究利用PacBio Sequel测序平台首次对其进行全长转录组测序和数据分析，结果共获得323 309个clean reads,自我矫正产生环形一致性序列(CCS)673 540个，预测得到蛋白编码区(CDS)序列28 447个；MISA软件共搜索得到沙鞭93 563个简单重复序列(SSR),分布于56 824条unigene上；转录本基因功能注释，共有166 541条序列得到NR注释，结果显示沙鞭与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)亲缘最近；KOG数据库比对将97 892个unigene分为25个功能类别，其中注释较多的功能为翻译后修饰、蛋白质周转和分子伴侣；GO数据库比对共注释到87 930个unigene,分为生物过程、细胞组成和分子功能3大类及62个亚类分支；KEGG结果表明碳水化合物代谢、信号转导、能量代谢通路中注释基因较多。本研究结果丰富了沙鞭的遗传信息，为今后沙鞭关键耐旱基因的挖掘提供了理论依据。     

马鼻肺炎

马鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis,ER)是马属动物几种高度接触传染性疾病的总称。其病原体为亲缘关系密切的两种疱疹病毒-马疱疹病毒1型(EHV-1)和马疱疹病毒4型(EHV-4)。EHV-1和EHV-4在全世界广泛分布,并对所有年龄和种类的马以及其它马科动物的健康构成严重的威胁。世界动物卫生组织将马鼻肺炎列为B类动物疫病。多年以来,马鼻肺炎一直对世界养马业构成威胁。在大量饲养马匹进行传统耕作或以之作为农业经济一部分的国家中,EHV-1和EHV-4这两种病毒感染呈地方性流行。从马以外的其它马属动物,如斑马、亚洲野驴和驴,已经分离到与EHV…     

蒙古马、纯血马eCG分泌水平的研究

本实验通过ELISA检测不同生理状态下的蒙古马和纯血马妊娠母马在妊娠30～100d体内eCG的表达水平,比较品种、母马年龄、胎儿性别对母马eCG分泌水平的影响。结果表明:蒙古马eCG效价在妊娠第60天出现峰值,平均值为82.1IU/mL,100d出现最低值16.6IU/mL,年龄对蒙古马eCG表达水平有影响,3～5岁组极显著高于大于10岁组(P0.01)。纯血马在妊娠60deCG效价到达峰值,平均值为64.8IU/mL,在妊娠第30天出现最低值10.8IU/mL。怀雌性胎儿纯血马eCG分泌水平极显著高于怀雄性胎儿的纯血马(P0.01)。蒙古马eCG的表达水平极显著高于纯血马(P0.01)。     

马疱疹病毒1型感染马疾病模型的建立及评价

试验旨在建立马疱疹病毒1型（Equine herpesvirus type1,EHV-1）人工发病模型,确定EHV-1感染马的半数感染量（ID₅₀）及感染发病的判定标准,为该病的预防与治疗药物的研发奠定基础。以新疆伊犁地区某发病马场流产胎儿中分离的EHV-1 XJ2015株为研究对象,设立4组不同病毒剂量感染组及对照组,经鼻内喷雾感染马,5 mL/匹,每天观察试验马的临床症状和发病情况,14 d后进行剖检,观察各组织脏器病理变化并应用实时荧光定量PCR方法检测鼻腔排毒及病毒分布情况。结果显示,EHV-1 XJ2015株感染马的ID₅₀为10^-6.67/5 mL,其病毒含量为10^4.33 TCID₅₀/mL。与对照组相比,1×10⁶和1×10⁵ TCID₅₀/mL感染组马临床评分显著升高,主要表现为体温升高（高达39.5 ℃,一般持续2~6 d）、食欲不振、流浆液性鼻液和下颌淋巴结肿大;且1×10⁶和1×10⁵ TCID₅₀/mL感染组试验马均表现出不同程度的排毒,肺脏及脑组织中可检测出大量病毒,与对照组相比极显著或显著升高（P<0.01;P<0.05）;病理学检查发现,患马脑组织出现非化脓性脑炎及神经元水肿,肺脏组织出现间质性肺炎、嗜中性粒细胞、炎性细胞浸润、出血和肺泡间隔增厚。以上结果表明,EHV-1 XJ2015株对马具有较强的致病性,患病马临床症状典型,病毒主要随鼻液排出,并富集在肺脏及脑组织,通过上述指标确定EHV-1感染马发病的判定标准,本试验成功建立EHV-1感染本体动物疾病模型。     

马源人乳头瘤病毒18型的鉴定及遗传进化分析

为了解新疆地区马携带病毒的多样性,本研究采集新疆昌吉市和伊宁市30匹纯血马,147匹本土马粪便、鼻拭子和血清样品,采用高通量测序检测马携带病毒多样性。结果显示马粪便携带人乳头瘤病毒18型(HPV18)。根据GenBank中HPV18参考株E6基因序列,设计特异性引物,对样品进行PCR检测。结果显示20%(6/30)纯血马粪便样品携带HPV18,与其同场饲养的本土马粪便样品HPV18阳性率为12.7%(7/55),非同场饲养的本土马粪便样品HPV18阴性(0/92),表明马源HPV18可能是由纯血马携带的病毒。此外,马鼻拭子和血清样品中未检测到HPV18,表明该病毒可能仅存在于马肠道中,这也是本研究首次在动物肠道中检测到HPV18。马源HPV18 E6基因核苷酸和氨基酸序列与国外HPV18 E6基因与氨基酸序列同源性为99.6%～100%、100%,与我国HPV18 E6基因与氨基酸序列同源性为94.6%～97.3%、91.8%～96.8%,与马乳头瘤病毒E6基因与氨基酸序列同源性为35.8%～40.1%、14.6%～24.6%。遗传进化分析显示马源HPV18与国外HPV18亲缘关系较近,而与马乳头瘤病毒处于不同分支,表明马源HPV18可能是由纯血马携带的外来病毒。本研究首次鉴定了马源HPV18并对其E6氨基酸进行遗传进化分析,为HPV18的流行病学研究提供了参考依据。     

马疱疹病毒1型ORF5基因分子特征分析及原核表达载体的构建

马疱疹病毒1型(EHV-1)对马产业造成严重的经济损失.该病的防控主要依赖疫苗免疫,但是现有的检测方法不能有效区分疫苗免疫与自然感染,给流行病学调查和疫病的防控带来了一定的阻碍.本研究聚焦EHV-1的非结构蛋白,以EHV-1 XJ2015株为研究对象,扩增ORF5基因进行其遗传进化分析、氨基酸序列差异性分析、蛋白质性质...     

马疱疹病毒8型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速检测马疱疹病毒8型(EHV-8)的方法，本试验以EHV-8的全基因组序列为模板，针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列，进行对比分析，设计EHV-8的特异性引物和探针，优化反应条件，建立EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证，使用该方法进行临床样本检测。结果显示，建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法对EHV-8 DNA模板的最低检测限为1.1×10² copies/μL,敏感性高；EHV-8与EHV-1、EHV-4、马流产沙门氏菌和肠产毒性大肠杆菌均无交叉反应，特异性强；批内重复性试验和批间重复性试验均表明该方法重复性好。对132份临床样本的检测结果显示，阳性检出率为10.61%,基因测序正确。由此可见，本试验建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法能够满足EHV-8的检测需求，且该方法敏感性高、特异性强、重复性好，为EHV-8的进一步研究提供了有效的辅助检测手段。     

马疱疹病毒2型研究进展

马疱疹病毒2型（equine herpesvirus 2，EHV-2）属于疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科，通常导致马呼吸道症状以及免疫抑制，进而引发其他疾病，现已成为引起马流产的潜在病原体。该病毒最大特点为潜伏感染，已流行于全世界，近年来我国也有检测到病毒的报道，这给养马业造成潜在威胁。目前对EHV-2致病机理尚不清楚，且未有针对EHV-2的疫苗，这给该病的防治带来一定的挑战。本文围绕EHV-2感染的病原学、国内外流行情况、临床表现、检测方法等进行了综述，以期为进一步研究提供参考。     

基于宏基因组学的鸭源样本中坦布苏病毒检测方法的建立

利用二代高通量测序技术建立检测鸭源样品中坦布苏病毒的方法。首先将样品过滤和经核酸酶处理,再利用等温链位移扩增(SPIA)技术快速制备样品总cDNA,最后经磁珠纯化和文库构建后,通过Ion Torrent进行高通量测序获得基因组信息。结果显示,通过SPIA扩增和核酸文库制备的优化,可从微量病原样本中获得327pmol/μL的核酸文库样本。Ion Torrent测序共获得1 725 436条reads,约6.2M数据,平均109bp。数据拼接并Blast发现,病原样品的核酸序列可注释鸭坦布苏病毒全部基因组数据,与首次发生在我国的鸭坦布苏病毒BYD-1株参考序列的同源性为100%。将所测病毒序列与其他5种黄病毒科成员进行同源性比对,发现与近3年发生在我国的鸭坦布苏病毒同源性最高,在98%以上。且NS基因进化树分析与鸭坦布苏病毒处于同一分支上,符合鸭坦布苏病毒特征。本研究建立的基于未知病原SPIA扩增结合高通量测序检测方法,可同步获知坦布苏病毒基因的核酸信息。     

马疱疹病毒1型gG蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为了解新疆马疱疹病毒1型(EHV-1)的流行情况,需要建立一种检测抗体的间接ELISA方法.采用纯化后EHV-1 XJ2015株的gG蛋白作为检测抗原,优化反应条件后建立检测EHV-1血清抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验及商品化试剂盒的应用效果对比.结果表明,该方法仅与EHV-1阳性血...     

新疆伊犁地区马疱疹病毒1型ORF30基因序列分析

为研究马疱疹病毒1型(EHV-1-XJ2015)新疆伊犁分离株致病基因型,评估新疆EHV-1-XJ2015的潜在风险因素,本试验设计特异性引物,应用PCR技术扩增EHV-1-XJ2015分离株ORF30基因相应区域,连接至克隆载体,成功构建重组质粒pMD19-T-ORF30。测序结果表明,EHV-1-XJ2015毒株ORF30基因2 254bp处为A,且编码天冬酰胺(N),分析证明EHV-1-XJ2015基因型为非神经型毒株,毒力倾向表现为流产型毒株;遗传进化显示,EHV-1-XJ2015毒株与日本分离株90c16、00c19、HH1、NY03为同一分支,氨基酸同源性最高为100%。本研究结果为开展EHV-1分子流行病学调查研究及为新疆地区现有诊断方法和防控措施的评估提供理论依据。