禽4型腺病毒knob蛋白的原核表达及纯化蛋白的免疫原性研究

为研究Knob蛋白的免疫效果,将合成的mknob基因克隆至p ET28a（+）表达载体,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,低温诱导表达,knob蛋白纯化后去内毒素,按不同剂量免疫SPF鸡。结果表明：重组质粒pET28a-mknob可以高效表达目的蛋白;Western blot结果表明,表达的蛋白可与禽腺病毒特异性血清发生特异性结合;免疫保护试验分析发现,10μg蛋白免疫SPF鸡即可产生100%保护。本研究为禽4型腺病毒亚单位疫苗的研发奠定了基础。     

禽腺病毒血清4型Fiber-2蛋白在大肠杆菌中可溶性表达及其免疫原性分析

旨在解决大肠杆菌表达系统对禽腺病毒血清4型(FAdV-4)Fiber-2蛋白进行表达时存在的多包涵体问题.通过添加不同的化学伴侣分子来提升Fiber-2的可溶性表达量,并进一步通过动物试验评价蛋白的免疫原性.结果 显示,添加化学伴侣分子p-环糊精显著提高了Fiber-2的可溶性表达量,且重组蛋白与FAdV-4阳性血清具...     

犬Ⅰ型腺病毒的分子生物学研究进展

犬腺病毒Ⅰ型（CAV-1）是传染性犬肝炎（infectious canine hepatitis，ICH）的病原。犬及狐对本病毒易感，各种年龄特别是2月龄到1岁的幼犬易感性更大，自然条件下还可感染狼、猫、浣熊、黑熊等。该病毒可引起急性败血性传染病，主要表现肝炎和眼部疾患，狐狸则表现为脑炎。病毒存在于急性感染病例的全身组织以及各种分泌物、排泄物中，在慢性感染病例中，病毒主要存在于肾脏，     

表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒免疫原性测定

为测定表达犬瘟热病毒(CDV)H基因的重组犬2型腺病毒(CAV-2/CDVLPH)免疫原性,25只45-50日龄犬(抗CDV中和抗体小于1∶2,CAV-2 HI抗体效价小于1∶2)随机分为5组进行免疫犬试验,第1组为CAV-2/CDVLPH免疫组,第2组为pVAXLPH免疫组,第3组为pVAXLPH和CAV-2/CDVLPH联合免疫组,CDV弱毒疫苗组和pVAX1空载体组分别作为阳性和阴性对照组。利用间接ELISA和CDV中和试验检测免疫犬的抗CDV体液免疫水平、CAV-2 HI试验检测免疫犬的抗CAV体液免疫水平、淋巴细胞转化试验检测免疫犬的抗CDV和抗CAV-2细胞免疫水平,分析CAV-2/CDVLPH的免疫性。结果,能够在各试验组免疫犬血清中检测到抗CDV ELISA抗体和抗CDV中和抗体,同时在第1组和第3组免疫犬的血清中检测到抗CAV-2的HI抗体,免疫犬的外周淋巴细胞对特异性和非特异性抗原刺激均有明显增殖,第2组的免疫应答水平低于第3组,第1组又高于第3组,但低于CDV弱毒疫苗免疫组,试验表明CAV-2/CDVLPH可同时诱导免疫犬产生抗CDV和CAV特异性免疫,CAV-2/CDVLPH与pVAXLPH相比能诱导犬产生较高的特异性免疫应答,然而低于CDV弱毒疫苗。     

鸭源坦布苏病毒E蛋白的可溶性表达及免疫原性研究

用RT-PCR扩增鸭源坦布苏病毒YY5株的E蛋白基因片段,分别插入到表达载体pMBP-c、pET-GST、pET-His、pET-DsbA中,构建了一系列原核表达载体,转化人大肠杆菌E.coli Trans10或DE3(plysS)宿主菌。工程菌株经诱导后进行SDS-PAGE,结果显示MBP-E融合蛋白得到了有效表达并且以可溶性蛋白的形式存在,且能与自然感染康复的鸭源多抗和鼠源单抗反应。以MBP-E免疫小鼠制备的高免血清,在体外可以中和DDTMUV,中和抗体效价达到1:46。重组蛋白MBP-E具有良好的免疫反应原性、免疫原性和体外免疫保护特性,这为进一步研制DTMUV重组亚单位疫苗奠定基础。     

造血器官坏死病病毒M蛋白的可溶性表达及免疫原性分析

为在大肠杆菌中高效表达出可溶性的传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）基质蛋白M,并分析其免疫原性,构建了pMAL-c2x-m原核表达质粒,优化表达条件并纯化MBP-M融合蛋白;对蛋白进行Western blot和DDA鉴定;将鉴定后的蛋白免疫BALB/c小鼠,利用Western blot鉴定鼠抗MBP-M血清,通过间接ELISA检测该血清效价。结果显示：在大肠杆菌中获得了可溶性的MBP-M蛋白,其相对分子质量约为64 kDa,与预期结果一致;MBP-M蛋白在IPTG为0.5 mmol/L,25℃诱导12 h时上清表达量较高;经Western blot鉴定,MBP-M蛋白可与鼠抗血清发生特异性反应,而不与阴性对照血清发生反应;ELISA检测血清效价达1:25 600。结果表明,本研究获得的MBP-M蛋白具有较好的免疫原性,这为IHNV基因工程疫苗研发奠定了基础。     

蓝舌病Ⅰ型病毒VP5蛋白的表达纯化及免疫原性分析

为分析蓝舌病Ⅰ型病毒(BTV-1)VP5蛋白的免疫原性,本研究构建了载体PET-28a-VP5并转化BL21(DE3),然后进行IPTG诱导表达,以及SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,重组VP5蛋白相对分子质量约为62 kDa,与预期结果一致。进一步优化条件,发现IPTG为0.2 mmol/L、温度为25℃、诱导6 h时,重组蛋白在上清中表达量最高,通过Ni柱纯化获得的重组蛋白纯度约为75%。将纯化后的重组蛋白VP5分别以40μg/只和20μg/只免疫Balb/c小鼠,同时设置PBS为阴性对照,对三免后血清进行间接ELISA检测,发现高、低剂量免疫小鼠均能产生针对VP5蛋白的特异性抗体。用灭活BTV-1进行DOT-ELISA检测,发现其能与VP5蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应,说明利用大肠杆菌表达的重组蛋白VP5具有良好的免疫特性,这为进一步开展BTV相关研究奠定了基础。     

犬Ⅰ型腺病毒TN株的分离鉴定

应用MDCK细胞采用单层吸附接毒和带毒传代的方法，从新疆阿克苏送检的犬粪便中分离出1株犬腺病毒，并对其进行了形态学、理化学、血清学、动物感染试验、分子生物学鉴定。结果证明所分离的TN株为1株CAV－I病毒的强毒株。     

鸭坦布苏病毒全长E蛋白可溶性表达及免疫原性分析

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)引起的一种以产蛋量和采食量严重下降为主要特征的传染病。应用RT-PCR方法扩增DTMUV GDHD2014-3毒株的囊膜(E)蛋白全基因序列,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c5x,构建重组表达质粒E-pMAL。将其转化E.coli BL21感受态细胞,经诱导表达条件优化,在30℃条件下IPTG诱导,可溶性表达重组的全长E蛋白(rf E),大小约110 ku。用Amylose Resin对目的蛋白进行纯化,并将纯化的rf E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆血清抗体。经Nu-PAGE以及Western blot分析,成功实现rf E蛋白可溶性表达,并能与DTMUV灭活疫苗免疫鸭血清多抗产生特异性反应。间接免疫荧光试验结果表明,rf E蛋白免疫小鼠获取的多克隆血清抗体能与DTMUV反应。实现了rf E蛋白的可溶性表达及纯化,并验证rf E蛋白具有良好的免疫原性,为DTMUV的亚单位疫苗的研制以及相关诊断试剂的开发奠定了基础。     

表达猪CD3ε蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性测定

CD3分子是T细胞重要的表面分子,表达于成熟T细胞表面,与TCR组成TCR—CD3复合物,在T细胞的分化增殖以及功能方面有着重要的作用。自1979年Kung等首次制备了抗人类CD3单克隆抗体OKT3以来,陆续有多种动物的CD3单克隆抗体被成功制备。CD3分子的单克隆抗体在T细胞亚群检测等方面具有重要的应用价值。猪CD3单克隆抗体制备在国内还未见报道。CD3由γ、δ、ε、ξ、η五条多肽链组成,其中多数单克隆抗体均是针对ε链。本研究成功构建了表达猪CD3ε基因的重组腺病毒,并对其免疫原性进行了测定,以期为猪CD3ε单克隆抗体的制备奠定基础,并为其他细胞表面分子单克隆抗体的制备提供借鉴。     

东北虎感染犬腺病毒Ⅰ型病例分析

2018年9月5日,吉林省野生动物救护繁育中心发生1例自繁自养的东北虎感染犬腺病毒Ⅰ型病例。该病例从发病到死亡病程较长,以食欲下降至废绝,饮水量降低,精神萎靡不振,呕吐,眼窝凹陷为特征。剖检发现,肝脏颜色暗黑,肾脏肿大,脾脏肿大,胃部有出血,牙龈及口腔色泽苍白无血色。临床血液生理生化指标检测显示,此虎贫血,肝、肾功能损伤。通过试纸条检测确诊感染犬腺病毒Ⅰ型病毒。     

表达牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

为构建牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSRS2基因,构建克隆质粒pMD18-T-NcSRS2、重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcSRS2及表达质粒Transpose-AdNcSRS2,脂质体介导转染QBI-HEK293细胞,包装重组腺病毒Ad5-NcSRS2,PCR检测重组腺病毒NcSRS2基因,IFAT和Western blotting检测NcSRS2基因在QBI-HEK293细胞中的表达,测定病毒滴度后,收集病毒液免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平.结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫NcSRS2基因大小为1 227 bp,与GenBank中发表的NcSRS2( AF061249)核苷酸序列相似性为99％;重组腺病毒Ad5-NcSRS2在293细胞中包装成功,表达蛋白的相对分子质量为43 ku,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSRS2滴度为109TCID50·mL-1,间接ELISA检测二免后3周BALB/c小鼠血清中IgG抗体效价达1 ∶ 2 048.本研究成功构建了具有良好免疫原性的重组腺病毒Ad5-NcSRS2,为牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础.     

表达PEDV中国变异株S蛋白复制型重组人腺病毒4型的构建及其免疫原性研究

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp~1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重组,得到含有PEDV S基因的重组HAdV-4感染性克隆,纯化的感染性克隆DNA经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,拯救得到表达PEDV变异株S蛋白的重组病毒rAd4△E3-S。将该重组病毒免疫小鼠,间接ELISA测定其血清中抗S蛋白抗体水平,利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,重组病毒能够表达PEDV S蛋白,并且能刺激小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答。本实验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫反应奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供实验依据。     

血清1型Ⅰ群禽腺病毒Fiber-2蛋白的表达及其中和作用研究

为研究血清1型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-1)的Fiber-2蛋白对FAdV-1在细胞水平上的中和作用,研究根据FAdV-1亚型Fiber-2基因序列设计引物,进行Fiber-2全基因序列PCR扩增并构建重组质粒,转入BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫SPF鸡制备抗血清,通过鸡LMH细胞研究Fiber-2蛋白抗血清对FAdV-1感染的中和作用。结果显示,FAdV-1 Fiber-2基因扩增产物大小为1 233 bp,构建了pCold-FAdV-1-Fiber-2重组质粒,表达的FAdV-1 Fiber-2蛋白分子量大小为105 ku;FAdV-1 Fiber-2蛋白的抗血清孵育LMH细胞后,与阳性对照组相同第4天细胞出现病变,而阴性对照组细胞均无病变。结果表明,FAdV-1 Fiber-2蛋白抗血清在体外试验中不能中和本血清型病毒的感染,FAdV-1 Fiber-2蛋白作为亚单位疫苗的研究存在风险。     

猪圆环病毒2型山西流行株Cap蛋白可溶性表达与免疫原性分析

为建立猪圆环病毒2型(PCV2)山西流行毒株Cap蛋白的原核可溶性表达体系,并分析比较重组蛋白与2种商品化基因工程Cap亚单位疫苗在小鼠体内不同阶段的免疫原性,本试验以PCV2e SXJX株(GenBank登录号：MH922991.1)的ORF2基因为基础,根据大肠埃希菌密码子偏性优化序列,将其插入原核表达载体pET-28a-c(+)中,鉴定为阳性后转入宿主菌BL21(DE3)中,经优化表达条件后,对超声破碎后的菌体上清进行纯化,分析纯化后产物的纯度和抗原性,并利用负染透射电镜观察重组Cap蛋白体外自组装成病毒样颗粒(VLPs)。分别将同等免疫剂量的PCV2e重组Cap蛋白和2种商品化PCV2基因工程亚单位疫苗免疫健康BALB/c雌鼠,应用ELISA方法检测不同阶段小鼠体内特异性抗体的水平。结果显示：重组Cap蛋白可在大肠埃希菌中表达,以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中,表达产物纯化效果良好,并能被PCV2单克隆抗体识别;透射电镜观察结果发现,表达的重组Cap蛋白可以自组装成约20 mm大小的VLPs;动物免疫试验结果显示,在首免后第21天PCV2e Cap试验组抗体水平显...     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的可溶性表达及其免疫原性研究

VP2蛋白是鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要结构蛋白及保护性抗原,为了研究原核表达的IBDV VP2可溶性蛋白的免疫原性,从IBDV超强毒SD株克隆出VP2基因,将其克隆于pET-30a原核表达质粒,并转化至大肠杆菌菌株BL21中,诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot分析,发现在37 kDa处出现特异性蛋白条带,与预期结果一致,且大部分VP2蛋白存在于菌液上清液中。经诱导条件的优化,菌液上清液表达的VP2蛋白琼脂扩散(AGP)效价可达1∶16。用不同AGP效价的VP2蛋白乳化配苗,免疫SPF鸡,免疫后21 d,进行AGP抗体效价测定及攻毒保护试验,发现VP2蛋白以AGP效价不低于1∶8配苗,免疫鸡用超强毒SD株及经典株BC6/85株攻毒,保护率均为10/10。结果表明,成功获得了表达VP2可溶性蛋白的基因工程表达菌BL21-VP2,且表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立

通过分析对比GenBank公布的几株犬Ⅰ型腺病毒序列,针对犬Ⅰ型腺病毒特有的E3区,设计了1对特异性引物。对引物浓度、退火温度、扩增体系等条件优化后,建立了犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法,并对40份CAV-Ⅰ人工感染银黑狐的粪便样品进行了检测。结果表明,与普通PCR相比,建立的犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性强的特点。该检测方法可用于Ⅰ型犬腺病毒的快速诊断与监测,并能够定量分析CAV-Ⅰ的感染程度。     

一例犬冠状病毒Ⅰ型与犬腺病毒Ⅱ型混合感染的实验室诊断

本试验对1例2月龄中华田园犬进行病原诊断,该病犬主要症状为腹泻、血便并伴随流涕、打喷嚏、咳嗽等。采集其鼻拭子、肛门拭子,利用PCR方法分别对7种常见的犬腹泻病毒及呼吸道病毒进行检测,结果显示该病例为犬冠状病毒Ⅰ型与犬腺病毒Ⅱ型的混合感染。待病犬进入濒死期立即安乐死并进行剖检,组织观察可见肺部出现明显的出血斑,盲肠、直肠、结肠有明显的出血点。本试验为犬病毒性腹泻、呼吸道疾病的病毒诊断以及犬冠状病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型自然感染引起的组织病变提供了参考。     

表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒VP1蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-I)VP1蛋白的重组腺病毒,本实验采用RT-PCR方法扩增DHV-Ⅰ HP-1株VP1基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,并将其电转化于含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183中,通过同源重组制备含有重组腺病毒的质粒.重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒(rAd-VP1).间接免疫荧光和western blot鉴定结果显示,DHV-Ⅰ的VP1蛋白在重组腺病毒感染的AD293中获得表达.rAd-VP1的制备为鸭免疫实验效果评价奠定了基础.