牛miR-29b影响牛病毒性腹泻病毒感染BALB/c小鼠的作用

前期研究发现高表达miR-29b能显著抑制牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)在体外的复制,而miR-29b过表达是否影响BVDV在体内的复制尚未见有报道。研究设计扩增牛pre-miR-29b基因片段的引物,以MDBK基因组为模板,PCR扩增pre-miR-29b并克隆至慢病毒载体pLL3.7。将阳性质粒pLL3.7-pre-miR-29b与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装慢病毒并测定慢病毒滴度,同时包装pLL3.7空质粒的慢病毒作为阴性对照。将4～5周龄BALB/c小鼠随机分成5组,每组6只,连续2次尾静脉注射2.5×10~7 IU慢病毒悬液pLL3.7-pre-miR-29b或pLL3.7,并于慢病毒注射后96 h通过滴鼻途径攻毒BVDV毒株NADL(1.68×10~5 TICD_(50)/只),于攻毒后不同时间(0,2,4,10,15 d)处死BALB/c小鼠,采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、小肠和血液,提取总RNA,使用荧光定量RT-PCR检测不同组织中BVDV拷贝数;同时制备病理组织切片观察各组织病变情况。结果显示,成功构建pLL3.7-pre-miR-29b质粒;成功包装pLL3.7-pre-miR-29b和pLL3.7慢病毒;使用荧光定量RT-PCR检测发现,pLL3.7-pre-miR-29b感染能显著性降低BVDV拷贝数;与pLL3.7-pre-miR-29b感染的处理组相比较,pLL3.7感染的对照组中各组织病变情况较为严重。结果表明,BALB/c小鼠体内过表达miR-29b能明显抑制BVDV的复制,减轻BVDV感染造成的病变,为以后研发抗BVDV的有效策略和方法提供了理论依据。     

Balb/c小鼠耳廓组织学观察

应用常规石蜡包埋,HE染色观察Balb/c小鼠耳廓组织结构。结果显示,小鼠耳廓包括以下组织结构:①表皮由复层扁平上皮组成;②真皮有大量弹性纤维,细胞成分较少,还可见皮脂腺;③弹性软骨呈现连续片状分布,在贴近软骨纤维膜的位置并行不连续的纵肌;④软骨细胞呈现单层或双层排列,由较粗的弹性纤维包裹。以上观察结果表明Balb/c小鼠耳廓组织结构具有自身的特征。     

呼吸道合胞病毒F蛋白表位与Balb/c小鼠血清白蛋白融合表达及其纯化

为了更深入的研究呼吸道合胞病毒F蛋白优势表位的抗原性,采用生物信息学技术,预测呼吸道合胞病毒F蛋白的抗原表位,选取F205～223与F255～278两个小片段表位作为候选研究对象,构建了编码F蛋白两个表位与Balb/c小鼠白蛋白结构域Ⅰ的融合基因,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中融合表达,表达蛋白采用金属亲和层析法纯化,Western blot检测.结果显示,通过大肠埃希菌原核表达的融合蛋白以包涵体的形式表达,采用尿素变性,亲和层析法纯化后可以获得高纯度的融合蛋白.     

鹅细小病毒三种疫苗对Balb/c小鼠的免疫效果

为了研究鹅细小病毒灭活苗、亚单位疫苗、核酸疫苗3种疫苗对Balb/c小鼠的免疫效果,试验自制了这3种疫苗,对Balb/c小鼠进行3次免疫,应用间接ELISA方法测定体液免疫水平。结果表明:用小鹅瘟灭活苗、小鹅瘟VP3基因亚单位疫苗免疫Balb/c小鼠,在三免后第21天抗体的P/N值达到峰值,分别为8.21,3.56;小鹅瘟VP3基因核酸疫苗在三免后第28天,抗体的P/N值达到峰值,为2.09。说明这3种疫苗中小鹅瘟灭活苗对Balb/c小鼠的免疫效果最好。     

山羊源牛无浆体对Balb/c小鼠感染性研究

牛无浆体(Anaplasma bovis)隶属无浆体属(Anaplasma),可感染动物单核细胞和组织巨噬细胞，对动物生产性能影响较大。用单核细胞分离方法得到山羊源牛无浆体，并将其接种至人工饲养的Balb/c小鼠，接种时分别设置高、中、低剂量组、阴性对照和空白对照。结果发现，高剂量组和中剂量组接种后3、6、9 d的血涂片检查和PCR扩增均可查到牛无浆体，9 d后转阴；低剂量组Balb/c小鼠不同时间点检查时牛无浆体均呈阴性。表明从山羊单核细胞直接分离牛无浆体可以感染Balb/c小鼠，接种9 d内可持续感染，为牛无浆体的动物感染模型的建立奠定了基础。     

Balb/c小鼠线粒体转录终止因子3基因克隆及其组织表达分析

旨在获得Balb/c小鼠线粒体转录终止因子3(MTERF3)基因cDNA的序列特征并进行比较分析,揭示该基因的组织特异性表达规律。应用RT-PCR技术克隆Balb/c小鼠MTERF3基因cDNA编码区序列(CDS),采用MEGA6.0软件构建小鼠MTERF3基因系统进化树,并采用Northern blot、RT-qPCR和Western blot技术研究该基因在小鼠大脑、心、脾、肺、肾、肝、骨骼肌和睾丸等8种不同组织中的特异性表达规律。结果显示,Balb/c小鼠MTERF3基因cDNA的CDS序列大小为1239bp,编码412个氨基酸。小鼠MTERF3基因与大鼠MTERF3基因同源性高达91.1%。MTERF3基因mRNA和蛋白质在Balb/c小鼠各组织中均有不同程度的表达。结果表明,成功克隆了Balb/c小鼠MTERF3基因cDNA的完整编码区序列,并揭示了该基因在各组织器官的表达规律,为进一步研究MTERF3基因在实验动物体内的功能奠定了基础。     

BALB/c小鼠结肠癌皮下转移模型的建立

体外培养人结肠癌细胞株HCT-8,将2×107个/mL人结肠癌细胞(HCT-8)悬液0.2 mL接种于BALB/c小鼠皮下,记录荷瘤生存时间,观察接种瘤生长及转移情况,死亡后解剖并做病理检查.结果显示,皮下转移发生率为94.00%(47/50),淋巴结转移率为96.00%(48/50).荷瘤鼠平均生存时间(60.20±7.60)d,病理结果提示,转移部位肿瘤细胞与接种部位肿瘤细胞结构相似,符合低分化腺癌的特征.本试验成功建立了小鼠结肠癌皮下转移动物模型.为结肠癌的相关研究提供参考.     

慢病毒介导稳定表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立

利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组Total RNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Realtime RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4～7d缩短为3.5d,TCID₅₀·0.1mL^-1由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。     

慢病毒介导稳定表达抑制PRRSV复制的shRNA细胞系的建立

利用慢病毒表达技术将稳定持续抑制PRRSV复制的shRNA导入Marc-145细胞,建立稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA的Marc-145阳性细胞克隆,并从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因的干扰效果。采用LR重组技术,将pENTR/U6/Nsp9-4、pENTR/U6/Nsp9-6及pENTR/U6/-CON分别与pDEST载体进行LR重组,获得表达骨架,重组后的表达载体在转染试剂介导下与已经优化的辅助质粒Vira PowerTM Packaging Mix共转染293-FT包装细胞,获得慢病毒样粒子,并用其感染Marc-145细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过PCR、CPE、TCID50、Real-time PCR和间接免疫荧光试验等方法分别验证上述细胞株的稳定整合以及其表达的shRNA对PRRSV增殖的抑制效果。结果显示:优势干扰序列和无关序列被稳定整合在靶细胞基因组上,无论观察细胞病变效应、免疫荧光产生情况、致细胞半数感染量还是实时定量分析相对表达量,与正常Marc-145和整合有无关序列的两株阴性对照细胞相比,整合有NSP9-4和NSP9-6的两株细胞由于表达了靶向抑制PRRSV复制的shRNA,PRRSV对其易感性降低,而且差别显著,分别将其命名为Marc/pU6/NSP9-4和Marc/pU6/NSP9-6。经验证,本研究成功构建两株稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA细胞——Marc/pU6/NSP9-4、Marc/pU6/NSP9-6,同时获得一株表达无意义shRNA的Marc/pU6-CON辅助细胞,该细胞表达的shRNA具有明显抑制PRRSV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因,也为PRRSV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等研究提供资料。     

小鼠病毒性肝炎模型的建立

为了建立病毒性肝炎小鼠模型,将103．875 TCID50／mL 小鼠肝炎病毒 A59（MHV-A59）经腹腔注入封闭群 NIH 小鼠体内,测定小鼠血清 ALT、AST、TP、ALB 含量等指标,并对肝脏组织病理学进行观察。结果表明,小鼠感染 MHV-A59后,约30％存活,肝脏组织呈现持续炎性改变,血清 ALT、AST 升高而 TP、ALB 有所下降。这些指标与人类病毒性肝炎的临床指标极为相似,可作为病毒性肝炎药物研究的比较理想的动物模型。     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒载体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒栽体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

Balb/c小鼠肺组织一氧化氮及一氧化氮合酶的动态变化

为探讨Balb/c小鼠正常生理状况下肺组织中一氧化氮自由基含量以及一氧化氮合酶活性的动态变化,采用电子自旋共振法直接测定了一氧化氮自由基含量,采用分光光度计法测定了一氧化氮合酶的活性.结果表明:在第3,6,7,12天Balb/c小鼠肺组织的一氧化氮自由基含量、一氧化氮合酶活性均无显著性差异(P＞0.05).说明生理状态下,Balb/c小鼠肺组织一氧化氮自由基的产生维持动态平衡.     

慢病毒介导的小鼠生长抑素shRNA序列的设计和筛选

生长抑素(SS)是一种多功能的脑肠肽,在动物生长轴中主要作为生长激素(GH)的负性调控因子。本研究通过慢病毒表达质粒介导shRNA,瞬时转染自身表达SS的BHK-21细胞,筛选出了靶向小鼠SS的最有效的siRNA序列。首先,分别在小鼠SS基因mRNA的246、433和539bp处找到潜在靶位点,合成3条siRNA转录模板的发夹结构以及1条阴性对照,体外退火后插入pshRNA-copGFP lentivector构建重组质粒。然后,通过对转染BHK-21细胞的荧光观察、Real-time PCR、免疫组化以及RIA等检测,转染细胞SS在mRNA水平及蛋白水平均检测到不同程度的抑制(P<0.05)。其中,psh2(SS 433～451)表现出了最高的沉默效率(转染效率68.9%时,mRNA水平的沉默效率达59.3%,P<0.05;蛋白质水平的沉默效率达55.6%,P<0.05)。本研究为降低SS在动物体内的分泌,相应提高GH的浓度,进而为促进动物生长的研究奠定了基础。     

BALB/c小鼠肝螺杆菌感染模型的建立及其病理特征

建立BALB/c小鼠肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus,Hh)感染模型,旨在研究Hh在小鼠感染不同时期的病理特征。以Hh灌饲SPF级BALB/c雄性小鼠,于最后1次接种后第2、4、6、8周收集小鼠粪便提取DNA,PCR扩增Hh16SrRNA基因检测小鼠感染率;结果表明随时间延长,小鼠的Hh感染率逐步增加,获得了稳定的BALB/c小鼠Hh感染试验模型。接种后2、3、4和5个月,分别取小鼠肝脏、胃、盲肠和结肠,进行Hh16SrRNA基因扩增和病理组织学检查。结果显示,小鼠的肝脏、胃、盲肠和结肠组织均检测到了Hh的定植;小鼠肝细胞发生脂肪变性、肝小叶局灶性坏死、坏死灶周围有不同程度的炎性细胞浸润等病变,随时间延长,病变严重程度增加;少量小鼠胃黏膜下层有炎性细胞浸润、胃黏膜上皮坏死脱落;盲肠表现不同程度的炎性细胞浸润。该研究结果表明,Hh可引起小鼠肝炎、胃炎和盲肠炎。     

以 Balb／c 小鼠为动物模型的 PCV-2疫苗效力检验方法的建立

为建立以Balb／c小鼠为动物模型的 PCV-2疫苗免疫效力检验方法,选取4周龄 SPF级雌性Balb／c 小鼠20只,随机分成4组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组）,每组5只,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组分别背部皮下1点,背部皮下2点和背部皮下、腿部肌肉2点接种 PCV-2疫苗0．1、0．2、0．2 mL／只,Ⅳ组空白对照组不接种;各免疫组分别于首免疫后7、14、21 d 加强免疫一次,免疫后7、10、14、21、28、35、42 d 采血分离血清,用 ELISA 方法测定PCV-2特异性抗体,确定最佳免疫途径和免疫剂量。另选取4周龄 SPF 级雌性 Balb／c 小鼠,随机分成免疫组、攻毒对照组和健康对照组,免疫组和攻毒对照组于二免后14 d 用 PCV-2强毒株进行攻毒,比较各试验组小鼠在临床症状、病理变化、相对日增重、PCV-2核酸载量等方面差异性,确定小鼠动物模型检测指标。抗体测定表明,一免背部皮下、腿部肌肉2点免疫0．2 mL／只,间隔21 d 加强免疫为最佳免疫程序,免疫后35 d 抗体水平达到峰值,显著高于Ⅰ和Ⅱ组。对照组小鼠免疫攻毒后出现消瘦、被毛凌乱、精神紧张等临床症状,淋巴结肿胀、出血、肺脏出血等病理变化,相对日增重显著降低,PCV-2核酸载量差异在103以上等临床变化。本研究以 Balb／c 小鼠为动物模型建立了 PCV-2疫苗免疫效力检验方法,优化了小鼠免疫途径及剂量,确定了相应的检测指标及技术参数,为 PCV-2疫苗免疫效力检验奠定了基础。     

CP和NCP型牛病毒性腹泻病毒腹腔注射小鼠感染模型的建立

为了建立不同生物型牛病毒性腹泻病毒（BVDV）小鼠的急性感染模型,本研究将0.4 mL 104TCID50/mL致细胞病变型（CP型）BVDV NADL株和非致细胞病变型（NCP型）BVDV NY-1株分别经腹腔注射BALB/c小鼠,观察10 d,分别在感染后第4 d、7 d、10 d每组分别采集3只小鼠的血液、粪便后迫杀,无菌采集其心、肝、脾、肺、肠等组织样品分别进行相应检测。采集血液的血常规检测结果显示,与对照组相比,感染后第4 d、7 d和10 d,CP组和NCP组小鼠的白细胞、淋巴细胞和血小板数量均下降,在第7 d下降最明显;且感染后第7 d、10 d CP组小鼠的上述指标均低于NCP组。各组织、血液和粪便的荧光定量PCR检测结果显示,CP组小鼠在上述3个时间点血液中BVDV的载量均保持较高水平。感染后第7 d CP组和NCP组小鼠各组织中均能检测到病毒,其中血液中的病毒载量最高,对照组小鼠各组织均未检测到相应病毒。免疫组化检测感染后第7 d各组织中BVDV抗原的分布,结果显示,感染后第7 d CP组和NCP组小鼠各组织中均检测到了BVDV抗原,对照组小鼠则均未检测到相应抗原。...