鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为实现对鸭圆环病毒(DuCV)的快速检测,分析比对Gen Bank中登录的DuCV全基因组序列,在其保守区设计并合成一对特异性引物,将扩增的212 bp片段克隆入pMD-18T载体中,获得pMD18DuCV重组质粒,通过SYBR GreenⅠ荧光掺入法分别对系列稀释pMD18DuCV中DuCV特异性片段进行扩增,通过pMD18DuCV浓度对数与Ct值制作了标准曲线并推导出直线回归方程,二者相关系数(R~2)为0.9968,建立了DuCV实时荧光定量PCR检测方法,重复性和灵敏性检测结果表明重复性良好,检测下限为67.2拷贝/μL;将建立的DuCV实时荧光定量PCR检测方法分别对鸭肝炎病毒(DHV)、大肠杆菌、新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒、小鹅瘟病毒(GPV)核酸或cDNA进行特异性检测,结果表明特异性良好。初步应用结果表明,建立的DuCV实时荧光定量PCR方法检出率为26.4%(62/235),明显优于常规PCR检测结果15.3%(36/235)。     

鸡β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank上鸡β-actin基因的序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBR Green I染料建立了荧光定量PCR法（real-time PCR）。以常规PCR产物为标准品，建立了标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，标准曲线Ct值检测范围为12~31,扩增效率为95.1%；熔解曲线分析结果显示产物特异的单个峰，其Tm为88±0℃，检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4 h。本试验建立的鸡β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短，为β-actin基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础。     

鸡IL-6和IL-18基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立鸡白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素18(IL-18)基因实时荧光定量PCR(Realtime FQ-PCR)检测方法。应用RT-PCR方法扩增鸡外周血淋巴白细胞(peripheral blood leukocytes,PBLs)的IL-6和IL-18基因片断,分别克隆至pGM-T载体上,将浓度梯度的IL-6和IL-18基因的重组质粒DNA进行实时荧光定量PCR,并建立相应的标准曲线。经PCR、双酶切和测序分析显示,成功地构建了重组克隆质粒pGM-T-IL-6和pGM-T-IL-18。标准曲线分析显示,IL-6和IL-18基因标准曲线的Ct值与其标准品浓度的对数值之间有良好的线性关系,IL-6和IL-18检测的灵敏度均达到10拷贝/μL。为下一步应用实时荧光定量PCR技术检测IL-6和IL-18基因的转录水平奠定了基础。     

鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中鸭圆环病毒(DuCV)基因序列,在保守区设计了1对引物,建立了SYBER GreenⅠ荧光定量PCR检测鸭圆环病毒的方法。结果:该方法可检测到每个反应相当于1×102个拷贝的标准品DNA。与H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎病毒等不发生交叉反应,且具有良好的重复性。表明建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上DuCV感染的检测。     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速及量化的猪瘟病毒(CSFV)检测方法,设计扩增CSFV E2基因的特异性引物,建立Eva Green染料的RT-qPCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性测试,并检测疑似猪瘟病毒感染的临床样品.结果显示,所建立的RT-qPCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=1.000,具有良好的线性关系...     

新西兰兔Keap1基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中穴兔Keap1基因序列设计了特异性引物,经PCR扩增,从新西兰兔肝脏中扩增出Keap1基因的C端并连接至T载体上,获得重组质粒pMD-19T-Keap1C。以重组质粒作为质控标准品,通过标准曲线构建、敏感性、特异性和重复性检验,建立了检测兔Keap1基因的实时荧光定量PCR方法,并分析了Keap1基因mRNA在兔各组织中的表达差异。结果显示,Keap1基因检测的Ct值与标准品呈良好的线性关系,扩增效率为103%,R~20.99。利用建立的实时荧光定量PCR方法对新西兰兔各组织中Keap1基因mRNA表达水平进行检测,结果显示,Keap1基因在脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中均有表达,且肝脏中表达量最高,脾脏中表达量最低。本试验建立了兔Keap1基因的荧光定量PCR方法并检测了其mRNA在兔各组织中的表达情况,为后续开展兔Keap1-Nrf2-ARE信号通路的研究奠定了基础。     

鸡IL-15、IL-16和IL-18基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank上鸡白介素15(IL-15),白介素16(IL-16),白介素18(IL-18)基因的序列,在保守区设计并合成各自特异引物,并以β-actin基因为内参,采用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量PCR检测方法.将基因克隆至pMD19-T载体上,以各阳性质粒作为标准品,构建标准曲线,并进行了熔...     

猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人工感染CSFV后不同时期猪血浆中CSFV的载量。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,R²=0.999;敏感性高,最低检测限为1×10¹拷贝/μL;特异性强,与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%。人工感染CSFV后第7天猪血浆中CSFV载量达到峰值,之后逐渐降低。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、重复性好等优点,为CSFV的定量分析及临床诊断奠定基础。     

流产衣原体TaqMan实时荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

流产衣原体是导致绵羊地方性流产的主要病原体,给全球畜牧业经济发展构成了巨大威胁。为建立一种灵敏、特异且快速的检测流产衣原体的实时荧光定量PCR方法,依据衣原体蛋白酶样活性因子的基因组序列设计了针对检测流产衣原体的引物和TaqMan探针,对反应体系和反应条件进行了优化,对方法的灵敏度、特异性及重复性进行了评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,该方法的最低检测限为26 copies/μL,灵敏度是普通PCR的10倍;与其他可以引起类似症状的病原体无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%;对156份流产羊拭子的基因组进行检测,检出率为78.21%。研究表明,该方法可以很好的应用于流产衣原体的大规模临床样本检测,为流产衣原体病的高通量检测和流行病学调查提供技术手段。     

实时荧光定量PCR检测鸭源鹅细小病毒方法的建立与应用

为建立一种快速且准确检测鸭源鹅细小病毒（D-GPV）的实时荧光定量PCR方法,本研究通过分析D-GPV基因序列的保守区设计并合成一对特异性引物,构建携带NS1基因的重组质粒作为标准品,绘制实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品的检测。结果显示,该方法标准曲线的的线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,检测底限为10拷贝;特异性与重复性好,与其他病毒无交叉反应,批间和批内变异系数均低于1%。该方法对人工感染D-GPV鸭泄殖腔拭子和咽拭子样品的检测结果显示,鸭在攻毒后第1 d即可以通过口腔和泄殖腔向外排毒,排毒量在第3 d达到高峰,排毒持续期可达到42 d。本研究所建立的实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性和稳定性好,可用于临床样品中的D-GPV检测。     

实时荧光定量PCR检测鸭疫里默氏杆菌方法的建立和应用

根据我们实验室发现的鸭疫里默氏杆菌（RA）荚膜多糖蛋白基因序列（DQ151838）,设计和合成荧光定量PCR引物和探针,建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法。该法的表达式Y=-3.416X＋39.492,相关系数1.000,PCR循环效率96.2%,DNA拷贝数在10^0～10^8范围内检测曲线有良好的线性关系。该法的最适Mg^2＋、引物和探针浓度分别为4～5mmol/L、0.16～0.2μmol/L和0.16μmol/L,最低能够检测到RA的DNA模板为2.0copies/μL。1/10半数致死量的RA人工皮下注射感染7日龄樱桃谷鸭后2h即可在心、肝、肺、胸腺、食管中检测到RA核酸;感染后8h即可在心、肝、脾、肺、肾、脑、胰、食管、气管、胸腺、法氏囊、十二指肠、直肠、血液和咽喉拭子检测到RA核酸,36～120h是RA在感染雏鸭除了咽喉、食管和气管各个组织器官繁殖数量最高峰期,其后逐渐下降。RA人工感染致死雏鸭的心、肝、脑RA分离和FQ-PCR检测符合率为100%。对临床送检具有典型鸭疫里默氏杆菌病临床症状和病理变化的死亡雏鸭的肝脏、心血和脑组织的FQ-PCR检测的阳性率均为100%,而RA分离的阳性率分别只有74.3%（26/35）、82.9%（29/35）和91.4%（32/35）。FQ-PCR可用于鸭疫里默氏杆菌感染的快速诊断、流行病学调查和鸭产品的检疫等。     

鸭NOD1荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立鸭先天免疫受体核苷酸寡域1(NOD1)的荧光定量RT-PCR检测方法,依据GenBank中鸡NOD1序列设计特异性引物,克隆获得鸭NOD1序列,设计鸭NOD1、凋亡相关碱性蛋白(ARBP)荧光定量RT-PCR特异性引物,以鸭脾脏mRNA反转录后的cDNA为模板,通过构建质粒阳性标准品,建立检测鸭先天免疫受体NOD1转录水平的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,建立的荧光定量RT-PCR方法对NOD1 mRNA的最低检测量为102拷贝,在1012~102拷贝范围内线性关系很好,R2≥0.999。该方法具有良好的特异性和重复性。应用于感染鸭疫里默氏杆菌Yb2株樱桃谷鸭脾脏中NOD1转录水平的检测,表明该方法可用于临床检测且适用性良好。     

实时荧光定量PCR检测鸡生长激素基因方法的建立

本研究旨在建立定量分析鸡生长激素(Growth hormone,GH)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法,为鸡GH基因mRNA表达水平的定量分析及探讨其与马立克氏病遗传抗性间关系奠定基础。根据GenBank数据库中鸡的GH基因序列,使用Oligo7软件在该基因保守区域设计合成一对引物并扩增GH基因片段,经回收纯化后连接到pGM-T载体,成功构建了含有GH基因片段的pGM-T-GH标准质粒。在此基础上,通过SYBR GreenⅠ染料法建立了pGM-T-GH重组质粒的实时荧光定量PCR标准曲线及其回归方程,成功建立了实时荧光定量PCR检测鸡GH基因的方法。     

血清1型鸭甲型肝炎病毒实时定量PCR检测方法的建立与初步应用

为建立了一种可检测血清1型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-1）的实时定量PCR方法,根据GenBank中DHAV-1 5,非编码区的保守区,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,以构建的重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,并对所建立方法进行了特异性、敏感性和可重复性试验以及临床病料检测初步应用。结果,该方法与血清3型鸭甲型肝炎病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒等无交叉反应性;最低可以检测到10copies/μL;组内和组间变异系数均小于3%;临床病料的检测结果与测序检测结果一致。结果表明,所建立的实时定量检测方法具有特异、敏感、稳定等优点,可用于DHAV-1的快速检测与定量分析。     

实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎标准方法的建立

根据GenBank(登录号:EF417996)中鸭病毒性肠炎病毒U31基因的序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,扩增片段长度为76 bp.以鸭病毒性肠炎弱毒疫苗株DNA为阳性标准品模板,建立了实时荧光定量PCR检测鸭病毒性肠炎病毒的方法.该方法能在鸭病毒性肠炎病毒DNA样本中检出荧光信号,定量范围为:2.1×109～2.1×100个拷贝数,最小检出量为2.1×100个拷贝;用该方法对人工感染试验的4只鸭组织器官、粪便、血液等样品重复测定3次,病毒模板DNA的检出率为100%,对鸭正常组织、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌和鸭病毒性肝炎、鹅源禽流感H5毒株、新城疫、小鹅瘟病毒等DNA检测不出现特异性荧光信号.经过重复性和实际临床样本检验证实,该方法真实可靠,而且从核酸提取到报告检测结果耗时不超过4 h,不仅实现了对鸭病毒性肠炎的快速诊断,也实现了对该病毒DNA由定性到定量的检测.     

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型（duck adenovirus A,DAdV-A）TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原（如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌）检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%（6/85）,PCR方法的阳性率为5.88%（5/85）,且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。     

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。     

鸭Toll样受体3实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸭Toll样受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)的基因序列保守区设计特异性引物,以鸭β肌动蛋白(β-actin)mRNA为内参,建立了一种检测鸭TLR3 mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法。该方法的标准曲线在1×102~1×108copies/μL范围内,具有良好的线性关系,相关系数和扩增效率均在0.9以上。熔解曲线显示,PCR产物为单峰,具有高度扩增特异性。重复性结果表明,该方法组内、组间变异系数均小于3%,最低检测浓度达100 copies/μL。利用该方法检测了TLR3在鸭组织器官中的表达和分布情况,结果表明,TLR3在鸭子的各种组织或器官中均有分布,其中以气管的表达水平最高,而在脾脏的表达水平最低。该检测方法的成功建立为研究TLR3在鸭天然免疫过程中的生物学功能提供了良好的技术手段。     

鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫。DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工程载体来开发疫苗。当前,尚未见仅针对DEV疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法相关研究报道。本研究通过分析DEV疫苗株和强毒株UL2基因特点,明确DEV疫苗株在UL2基因上存在528bp连续核苷酸缺失,设计针对该差异的实时荧光定量PCR引物,建立了EvaGreen实时荧光定量PCR检测DEV疫苗株的方法。结果表明,建立的检测DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,当UL2基因含量为5.25×101~5.25×106拷贝·μL~(-1)时有良好的线性扩增,其标准曲线方程Y轴截距为34.95,斜率为-3.218,扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%;敏感性强,最低检测限为52.5拷贝·μL~(-1);特异性好,对DEV疫苗株扩增产物的熔解曲线分析,仅出现1个单特异峰值[Tm=(90.62±0.28)℃],无引物二聚体,对其他鸭源传染病病原(如鸭肠炎病毒强毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、番鸭源鹅细小病毒、新型基因重组型鸭细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭源鹅多瘤病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.55%~1.72%和0.92%~2.49%。本研究建立了DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,为评价DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制提供参考。