猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白多克隆抗体的制备及其中和活性研究

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白鼠源多克隆抗体并检验其中和活性,试验采用RT-PCR方法扩增了PRRSV的Nsp9基因保守区域片段,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达重组Nsp9蛋白;纯化后的重组Nsp9蛋白与弗氏佐剂充分混合乳化,采用皮下多点注射免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,以血清中和试验和间接免疫荧光试验检验其中和活性。结果表明:试验成功扩增了大小为951 bp的Nsp9基因片段,经双酶切和序列测定,重组表达质粒pET-28a-Nsp9构建成功;重组Nsp9蛋白的分子质量约为36.0 ku;制备的多克隆抗体效价较高,重组Nsp9蛋白多克隆抗体经2～8倍倍比稀释时,与PBS对照相比荧光数量递增。说明在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达了PRRSV重组Nsp9蛋白,制备的鼠源多克隆抗体有一定的抗PRRSV中和活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒多克隆抗体的制备及免疫学活性研究

为了给猪繁殖与呼吸系统综合征的诊断、血清学调查、双抗夹心试剂盒的研制与开发奠定基础,试验将在Marc- 145细胞上传代的大量增殖的猪繁殖和呼吸系统综合征病毒纯化后并作为免疫抗原,采用ELISA方法检测多克隆抗体效价.结果表明:免疫获得的多克隆抗体效价为1∶12 800,该多克隆抗体有良好的中和活性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒多克隆抗体的制备及免疫学活性研究

为了给猪繁殖与呼吸系统综合征的诊断、血清学调查、双抗夹心试剂盒的研制与开发奠定基础,试验将在Marc-145细胞上传代的大量增殖的猪繁殖和呼吸系统综合征病毒纯化后并作为免疫抗原,采用ELISA方法检测多克隆抗体效价。结果表明:免疫获得的多克隆抗体效价为1∶12 800,该多克隆抗体有良好的中和活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

本研究将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)HuN4株的N基因克隆至原核表达载体pCold-Ⅰ中,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了重组His-N蛋白,蛋白分子量为14 kDa,能被PRRSV阳性血清特异性识别。经超声裂解和SDS-PAGE检测后,重组蛋白主要以可溶性形式表达。随后利用磁珠纯化重组蛋白,采用背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后获得多克隆抗体。Western blot和间接免疫荧光检测结果表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫反应活性,能够与真核表达或病毒的N蛋白发生特异性反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为体外表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）糖基化囊膜蛋白GP5,以及制备其多克隆抗体,以PRRSV PC疫苗株RNA为模板,应用RT-PCR扩增GP5基因,并克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达载体pET-32a-GP5。经过酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,加入IPTG低温诱导表达。使用亲和层析法纯化PRRSV GP5蛋白。然后将纯化的蛋白免疫北京大耳白兔制备多克隆抗体,并进行酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光分析（IFA）。结果显示,表达的PRRSV GP5原核蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,相对分子质量大约30 kDa;制备的GP5蛋白多克隆抗体ELISA效价可达1:64 000;IFA检测显示,制备的多克隆抗体能够识别PRRSV。重组PRRSV GP5蛋白及其多克隆抗体的成功制备为PRRSV血清学检测方法的建立提供了良好的生物学材料。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原,为了解析该病毒N蛋白抗原表位,本研究制备获得纯化的重组N蛋白,经过BALB/c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA方法筛选和Western blot鉴定,获得了7株稳定分泌抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清液抗体效价为1∶800～1∶25 600,其中8F1、5E2、2B1、12E1的重链类型为IgG1,4F1、2H2、5A2的重链类型为IgG2b,轻链类型都为κ型。间接免疫荧光试验显示7株单克隆抗体均与PRRSV感染细胞产生反应,可识别3种不同的B细胞线性表位,分别位于47～57 aa、57～67 aa及67～77 aa区域,其中57～67 aa为新发现的抗原表位。本研究结果为PRRSV诊断试剂盒的开发和流行病学调查提供了有用工具。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) Nsp7的免疫原性,本研究将PRRSV Nsp7进行了原核表达.SDS-PAGE和western blot试验表明,Nsp7在大肠杆菌中获得大量表达,并且其具有较好的反应活性.采用Nsp7免疫小鼠制备多克隆抗体,并进行间接ELISA检测,表明多克隆抗体效价达到1∶32000以上;间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别PRRSV的Nsp7,显示出Nsp7具有较好的免疫原性.本研究获得了高纯度可溶性的PRRSV Nsp7,并进一步制备多克隆抗体,为研究Nsp7蛋白的免疫学特性提供实验依据.     

重组N蛋白间接ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白作为包被抗原，建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法，并确定了ELISA最佳工作条件：抗原包被浓度为0．27μg/ml，37C1h加4C过夜，血清(1：40)和酶标免抗猪IgG(1：400)分别在37℃温育30min，底物溶液37℃显色15min。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高；与美国IDEXX试剂盒相比较，特异性和敏感性分别为97．6％和92．1％，无显著性差异。用已建立的方法检测临床血清样本187份，总阳性率为30．5％。     

针对不同形式猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白的抗体中和活性比较

GP5蛋白被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导中和抗体的主要蛋白,为探讨GP5蛋白诱导免疫保护的能力,本研究用杆状病毒/昆虫表达系统分别表达了全长和截短的GP5蛋白,同时用大肠杆菌表达系统表达了截短的GP5蛋白。三种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,以PRRSV全病毒作为ELISA包被抗原检测抗血清时,原核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶200,真核表达的全长GP5蛋白抗血清效价为1∶800,真核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶1 600。将获得的三种抗血清分别在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)进行PRRSV同源(PRRSV VR2332)和异源(PRRSV HeN-3)毒株的血清学中和试验,并通过实时定量PCR方法检测各组中PRRSV mRNA的绝对拷贝数,以抗血清的病毒阻断率≥70%的最大血清稀释度作为该血清的中和效价。结果显示:1)三种重组蛋白的抗血清对两种PRRSV毒株的中和效价均1∶2,不具有中和活性,部分稀释滴度的血清还增强了病毒的感染;2)抗PRRSV全病毒对照阳性血清对同源毒株的中和效价为1∶8,具有中和活性;对异源毒株的中和效价1∶2,不具有中和活性,同时还产生了ADE增强作用。上述研究结果提示,GP5的主要中和表位可能更多是构象表位,PRRSV全病毒中主要诱导中和抗体产生的蛋白可能并不完全在GP5蛋白上;PRRSV全病毒阳性抗血清虽然能够提供一定的免疫保护,但这种免疫保护只发生在同源毒株之间,对异源毒株并没有效果,反而会介导ADE效应发生。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR技术从细胞毒液中扩增N蛋白cDNA,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,所获得的重组质粒pET-28a-N经酶切鉴定正确后,将其转化入表达菌E.coliBL21plysS诱导表达,用SDS-PAGE与Western blotting对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为372 bp的N蛋白基因,诱导表达重组质粒pET-28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1 mmol/L时,诱导4 h蛋白表达量最高,出现分子质量约为18 ku的目的蛋白带,与N蛋白的理论值相符。经Western blotting检测,该表达产物可与PRRSV阳性血清发生特异性反应。获得的PRRSV N蛋白为建立针对该病毒抗体的间接ELISA检测方法,以及为进一步研发PRRS抗体检测试剂盒奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白抗体ELISA方法的现状与展望

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种以繁殖障碍为主的传染病.ELISA血清学检测是目前蓝耳病抗体检测最常用的方法,本文重点以检测PRRSV衣壳N蛋白产生的抗体建立起的ELISA方法进行论述,以期在猪蓝耳病抗体ELISA方法研究和选用方面有所帮助.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SX-1株N蛋白单克隆抗体的制备

用纯化的重组HIS标签N蛋白免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSVN蛋白的单克隆抗体（McAb）,经细胞融合获得5株可分泌特异性McAb的抗PRRSVN蛋白的杂交瘤细胞1A12,3F11,5A3,5F9,4E4。其中1A12,3F11,5A3,4E4杂交瘤上清与HIS-蛋白与GST—N蛋白两种抗原包被的ELIA反应均为阳性。5F9与HIS—N蛋白包被的ELISA反应为阳性,而与GST—N蛋白包被的ELISA反应呈阴性。单抗1A12,3F11,4E4,5A3与HIS-N与GST—N蛋白的Western blotting反应均为阳性,而5F9只与HIS-N反应。IFA检测显示1A12,3F11,5A3,4E4株单抗都有明显的荧光,说明其与PRRSV呈阳性反应。同时,ELISA检测又有很好的特异性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SX-1株N蛋白单克隆抗体的制备

<正>用纯化的重组HIS标签N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb),经细胞融合获得5株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞1A12,3F11,5A3,5F9,4E4。其中1A12,3F11,5A3,4E4杂交瘤上清与HIS-N蛋白与GST-N蛋白两种抗原包被的ELISA反应均为阳     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白与BCCIP蛋白相互作用的鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳(N)蛋白在病毒粒子组装和释放过程中发挥重要的作用。为筛选N蛋白与宿主细胞相互作用的蛋白,本研究分离健康猪肺泡巨噬细胞(PAM),构建了PAM的酵母cDNA文库,利用酵母双杂交方法筛选其中与PRRSV N蛋白相互作用的蛋白,结果获得3个阳性克隆。经测序并利用Blast方法比对GenBank数据库,筛选得到克隆插入的cDNA均与BCCIP(BRCA2 and CDKN1A interactingprotein)基因的1 bp～396 bp核酸序列一致。经酵母回返验证试验、GST-pulldown和免疫共沉淀试验验证了N蛋白与BCCIP之间的特异性相互作用,共定位试验显示N蛋白与BCCIP共定位于细胞核和细胞浆中。本研究鉴定了新的与PRRSV N蛋白相互作用的宿主蛋白BCCIP,BCCIP是否通过与N蛋白的相互作用参与PRRSV复制还有待深入研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性分析

分别用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb)。用纯化的PRRSV免疫小鼠,经细胞融合获得2株可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4B8、4D8。用重组N蛋白免疫的小鼠,经细胞融合获得3株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞2F3、4D5、5D11。间接ELISA检测4D8、4B8、4D5和5D11杂交瘤上清效价为1∶32~1∶512,而2F3的腹水效价为1∶12 800。单抗2F3、4B8和4D8与纯化病毒的Western blotting反应都为阳性,而4D5和5D11为阴性。IFA检测结果5株单抗都有明显的荧光,与PRRSV呈阳性反应。2F3的Ig亚型为IgM。5株单抗杂交瘤细胞连续传代至20代,分泌相应McAb的效价基本一致。本研究为PRRSV生物学诊断和方法研究提供有用工具。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体的筛选及其鉴定

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(Nsp2)的纳米抗体,本研究将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞,利用RT-PCR扩增其VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB5E噬菌体载体,构建双峰驼重链抗体可变区文库。利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,共筛选得到44株Nsp2特异性纳米抗体;经ELISA检测,结果显示44株Nsp2特异性纳米抗体均能与Nsp2蛋白特异性反应。本研究首次筛选到PRRSVNsp2特异性纳米抗体,为Nsp2蛋白的相关研究提供了必要的研究工具,同时为开发新型抗PRRSV药物奠定一定的基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是20世纪80年代末期出现的一种新病,它的症状主要表现为流产、早产、死胎、木乃伊胎、仔猪成活率急剧下降和育成猪呼吸道症状等.20世纪90年代中期猪繁殖与呼吸综合征先后在亚洲的菲律宾、日本、韩国、台湾省爆发.1996年,哈尔滨兽医研究所的郭宝清等人首次从国内阳性血清猪群中分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒,并证实我国也有该病发生.2006年,在我国大部分省份流行猪繁殖与呼吸综合征,该病又称为"猪高热综合征".     

猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白的研究进展

目前PBRS已成为国内外的研究热点,在开展了大量的调查与研究工作的基础上,PRRS在流行病学、免疫学及致病机理、实验室诊断技术、综合防治等方面都取得了新的进展。本文就PRRS病原在蛋白水平上的研究进展作一综述,为进一步研究PRRS的病原特性及其预防与诊断方法提供科学依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白间接ELISA方法的建立

为研制特异性敏感性较好的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体检测方法,更好地实现PRRSV的流行病学监测和诊断,将PRRSV GDr180毒株N蛋白基因序列克隆到p ET32a(+)载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内实现了高效表达,表达形式为可溶性表达,通过Western blot证明表达产物与PRRSV GDr180株阳性血清具有很好的反应原性和特异性。将大肠杆菌表达的N蛋白经过超声、离心、过柱纯化后,作为间接ELISA包被抗原检测血清中的PRRSV抗体,通过对各参数和试剂的优化建立了能检测PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法;对方法的特异性和重复性以及与同类成品试剂盒间的应用效果对比进行了试验。结果表明,研究建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中PRRSV抗体、监测猪繁殖与呼吸综合征的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。