利用昆虫杆状病毒表达系统表达PCV2 ORF2蛋白及其抗体的制备

猪圆环病毒(porcine circovius, PCV)最早是Tischer等于1974年在传代细胞系PK15中发现,该病毒可以持续感染PK15细胞,不引起细胞病变,对猪无致病性.     

奶牛孕酮单克隆抗体的制备及其鉴定

国内外研究表明通过对奶牛血液及乳汁中孕酮水平的检测能有效的用于奶牛发情鉴定、妊娠诊断及繁殖障碍性疾病的监测。本研究旨在制备鼠抗孕酮单克隆抗体,为奶牛孕酮免疫学检测技术提供研究基础。实验采用碳化二亚胺方法合成孕酮完全抗原,经SDS-PAGE电泳及紫外分光光度计扫描鉴定,结果表明孕酮免疫抗原(P4-BSA)及检测抗原(P4-OVA)合成制备成功。乳化后的P4-BSA经皮下免疫小鼠,三免后血清效价可达到1∶64000。采用聚乙二醇化学融合方法进行细胞融合,间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,最终获得一株能稳定分泌Ig G1型抗孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株,诱生的腹水经辛酸硫酸纯化制备,抗体的特异性较好。     

猪结合珠蛋白基因的克隆、原核表达及单克隆抗体制备

本研究的目的在于利用重组猪结合珠蛋白(Haptoglobin,Hp)制备特异性单克隆抗体.以梅山猪肝脏总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增猪hp基因,将其克隆到原核表达栽体pGEX-KG和pET-32a上,转化至E.coli BL21中,IPTG诱导下高效表达重组GST-Hp和HIS-Hp蛋白.用纯化的重组GST-Hp免疫BALB/c小鼠,用纯化的HIS-Hp作为包被抗原进行间接ELISA检测,通过淋巴细胞杂交瘤技术筛选阳性细胞株,制备单克隆抗体.结果表明筛选到2株高效分泌抗猪Hp单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3B4和3C8.Western-blot和间接ELISA检测均表明制备的单克隆抗体具有良好的特异性.     

触珠蛋白的生理功能及在奶牛上的应用前景

触珠蛋白(haptoglobin,Hp)广泛存在于人类和许多哺乳动物的血清及其他液体中,是一种应急蛋白(acute phase protein APP)。其主要在肝脏合成,也可在肺、脂肪细胞以及子宫内膜分泌。因此,触珠蛋白的合成表达受多种相关因素的调节。据研究报道,触珠蛋白可调节机体免疫,与哺乳动物的早期妊娠和机体免疫耐受都有密切关系。本文主要对Hp的结构和功能及在奶牛疾病和早期妊娠诊断上的应用前景作了介绍。     

奶牛结合珠蛋白生物信息学分析及其多克隆抗体的制备

结合珠蛋白(haptoglobin, Hp)是奶牛罹患乳房炎期间一种重要的标志性蛋白,其在血液和乳汁中含量变化与患牛乳房炎病情密切相关。为制备奶牛Hp多克隆抗体及了解其理化性质、结构和功能,本研究通过PCR成功扩增获得奶牛Hp完整CDS区序列,对其进行生物信息学分析和pQE-80L-Hp原核表达载体的构建。将测序成功的重组质粒转化至M15感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导重组蛋白的表达。重组蛋白表达后用亲和层析法进行纯化。利用纯化后的蛋白免疫动物制备多克隆抗体,利用ELISA方法和Western blot对多克隆抗体进行效价检测和反应性分析。结果显示,Hp是一种不稳定亲水性蛋白,分子式为C₁₉₃₆H₃₀₄₉N₅₄₅O₅₆₇S₁₉,编码388个氨基酸残基,由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲4种结构组成,有15个抗原决定族,36个磷酸化位点。在1～42氨基酸位置存在信号肽,无跨膜结构域与CD163、MMP9、CP等蛋白具有较好的互作关系。pQE-80L-Hp在大肠杆...     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人生长素

人生长素是由腺垂体分泌的一种在人体生长、发育及代谢中发挥重要作用的激素,具有广泛的生理作用。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bac-to-Bac表达系统,将人生长素基因(hgh)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,通过细菌转座子原理,转化BmDH10Bac细胞,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-hgh,并将其转染家蚕BmN细胞,获得含有hgh的重组杆状病毒。将此重组病毒感染家蚕BmN细胞,收集重组病毒液并穿刺接种家蚕5龄起蚕,3 d后观察到家蚕感染了杆状病毒的症状,并通过SDS-PAGE和Western blotting方法在家蚕血液中检测到分子质量约20 kD的目的蛋白,表明人生长素通过Bac-to-Bac系统在家蚕体内获得了表达。     

昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其应用展望

昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一,已广泛应用于重组蛋白的合成。该系统具有如多角体启动子控制下的高效表达,比较完善的转译后加工修饰,容易从无血清培养上清中纯化,无内毒素污染等特点。杆状病毒表达载体系统研究的最新进展:高强度早期启动子群杆状病毒转移载体的成功合成,以扩大寄主范围和增进重组蛋白稳定性为目的的亲本病毒的改造;通用的昆虫细胞培养基配方的不断优化,特定昆虫细胞株培养基的研制和适用于大规模悬浮培养的无血清培养基的商品化;旨在进行复杂糖基化及提供相对稳定细胞环境的宿主细胞工程;以新标记物(tag)载体和相关亲和层析方法为代表的蛋白质高效纯化方法的进步。昆虫杆状病毒表达载体系统在基础研究、医药卫生和农业上具有广阔的应用前景。     

杆状病毒表达系统及其表达传染性法氏囊病病毒基因研究进展

介绍了杆状病毒表达系统及其优点。简述了以杆状病毒为载体在昆虫细胞中高效表达传染性法氏囊病病毒基因的研究进展。该系统的表达产物具有高效多用、安全可靠及成本低廉等特点，认为以杆状病毒表达系统生产传染性法氏囊病病毒基因工程苗具有广阔的应用前景。     

杆状病毒表达载体系统研究进展

昆虫杆状病毒科(Baculoviridae)因包埋于多角体中的病毒粒子呈棒状而得名,迄今为止,用于基因工程的杆状病毒均属核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。NPV是一类双链DNA病毒,它的DNA是90—230Kb的环状分子。利用NPV作为外源基因表达载体的设想最初是由Miller 1981年提出。1983年     

奶牛孕酮单克隆抗体的制备及鉴定

奶牛妊娠的早期诊断,对奶牛生产具有重要意义,对于未妊娠母牛失误诊断,会错失下一个情期配种任务的安排,造成产犊间隔延长、繁殖率降低等问题。对早期妊娠的检测有多种方法,临床上通常把血、奶中孕酮的含量作为判断反刍动物怀孕与否的可靠依据。以甾体类激素孕酮为研究对象,利用琥珀酸酐法将11α-羟孕酮活化,运用碳二亚胺法选择BSA为免疫抗原载体,OVA为检测抗原载体与孕酮进行偶联反应,聚丙烯酰胺凝胶电泳表明偶联成功。P-BSA乳化后皮下免疫小鼠,3次免疫后血液效价最大达到1∶(243#10~3)。通过淋巴细胞杂交瘤技术获得针对孕酮的3株单克隆抗体细胞株2H3、2C3、C3H11。3株单抗诱生的腹水经纯化柱纯化,均未与雌二醇发生反应,特异性较好,为尽早检测出未妊娠牛,以适时治疗不孕牛、尽早淘汰劣质牛提供简便迅速的方法。     

杆状病毒表达载体系统研究进展

杆状病毒(Baculovirus)是一类超大双链环状DNA分子(约135kbp),因其成员的病毒体呈杆状而得名.这类病毒主要见于昆虫体内,是已知昆虫病毒中类群最大、发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒.其代表型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa Californica Nuclear Polyhedrosis Virus,AcMNPV)研究得最为深入.80年代初,国外学者发现多角体蛋白基因(polh)的强启动子及晚期大量表达的特性,Smith等首次建立了AcMNPV/秋黏虫细胞(spodoptera frugiperda,sf)表达系统,表达了人β干扰素.从此,以杆状病毒作为载体,在昆虫细胞或虫体内表达外源基因,形成了昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector System,BEVS).早期的BEVS有很多不足,如重组率较低、筛选困难、操作周期长、产物不易纯化等.短短20多年时间里,随着杆状病毒分子生物学研究的不断深入,杆状病毒表达系统迅速发展,不断完善,已成为当今基因工程领域四大表达系统之一,在研究基因表达调控、蛋白质结构和功能分析及各种生物活性物质的制备等方面发挥着越来越重要的作用.     

昆虫杆状病毒表达系统的新技术

昆虫杆状病毒表达系统自上世纪八十年代成功以来发展很快,近年产生了许多新技术,主要包括快速产生重组病毒的技术、改造昆虫细胞系使表达蛋白糖基化以及提高和稳定昆虫细胞中蛋白的表达水平等。     

绿色荧光蛋白的真核表达及其单克隆抗体制备

【目的】构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的重组猪痘病毒(recombinant Swinepox virus, rSWPV),制备抗GFP单克隆抗体。【方法】首先合成3′-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV(SWPV-JX20G株)同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His。重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定。【结果】PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色。EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体...     

利用杆状病毒表达系统表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

从GenBank下载传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,根据昆虫细胞偏爱密码子对IBDV VP2基因进行密码子优化,化学合成优化后的VP2基因序列,然后构建杆状病毒表达载体pTri Ex-4-VP2,构建成功的重组杆状病毒pTri Ex-4-VP2转染sf9细胞,制备病毒原种,采用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定VP2的免疫原性。结果显示:细胞感染Bac-VP2后,其细胞裂解蛋白在58 ku附近有1个条带,且该条带与IBD阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示VP2基因能在Sf9细胞中表达;动物攻毒保护试验中,2次免疫重组VP2蛋白后能诱导14日龄SPF鸡产生对IBDV强毒攻击,保护率为60%。本研究为进一步研究IBDV VP2基因工程疫苗提供了物质基础。     

利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素和λ1干扰素

牛干扰素可用于对各种类型牛传染性疾病的预防和治疗。利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素(BoIFN-α)及牛λ1干扰素(BoIFN-λ1)。首先对BoIFN-α和BoIFN-λ1的编码基因序列进行优化合成,优化合成的BoIFN-α和BoIFN-λ1基因的密码子适应指数(CAI)值提高,更适合在家蚕中表达,且翻译后的氨基酸序列与原始氨基酸序列完全一致。将优化合成的2个基因序列分别克隆至杆状病毒转移载体pVL1393,与缺失了orf1629的亲本杆状病毒BmBacmid共转染Bm N细胞,通过同源重组将BoIFN-α和BoIFN-λ1基因插入到杆状病毒多角体蛋白基因启动子下游,获得重组病毒rBmBac-BoIFN-α和rBmBac-BoIFN-λ1。用纯化的重组病毒感染家蚕5龄幼虫融合表达BoIFN-α和BoIFN-λ1干扰素,并通过PCR鉴定了2个目标蛋白基因在蚕体内的复制。采用微量细胞病变抑制法在Vero/VSV*GFP表达系统检测蚕体中表达重组BoIFN-α的效价可达1.0×10~6U/mL左右,重组BoIFN-λ1的效价可达5.01×10~4U/m L左右。试验结果提示,利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内表达牛α干扰素及牛λ1干扰素是生产牛干扰素制剂更加廉价而高效的途径。     

赤羽病病毒Gcaa465～704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465～704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc_aa465～704蛋白,纯化后免疫小鼠;通过细胞融合和亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞,利用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)对mAb特性进行鉴定。结果显示,本试验成功筛选出1株可稳定分泌抗AKAV Gc_aa465～704蛋白mAb的杂交瘤细胞株4D1,Western blot结果显示,mAb 4D1可特异性识别AKAV Gc_aa465～704蛋白;IFA结果显示,mAb 4D1能够与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。结果表明,本试验成功制备抗AKAV Gc_aa465～704蛋白mAb,为进一步研究AKAV Gc蛋白生物学功能和建立AKAV检测方法提供技术支持。     

利用重组杆状病毒表达口蹄疫病毒基因研究进展

杆状病毒表达系统是一种新型、高表达的真核表达系统,广泛应用在新疫苗、诊断试剂和新型蛋白药物开发研究方面。不少研究人员报道了利用重组杆状病毒表达口蹄疫病毒基因生产结构蛋白和非结构蛋白,期望表达的蛋白质具有与真实病毒蛋白相似的生物学活性,能够应用于候选疫苗或诊断检测抗原。作者对近几年利用重组杆状病毒表达口蹄疫结构蛋白基因和非结构蛋白基因的研究进展进行了综述,并提出相关问题和困难供商讨。     

利用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase,L-ASP）可以通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成,导致肿瘤细胞的死亡。通过杆状病毒的Bac-to-Bac方法,将大肠杆菌的asp基因在家蚕杆状病毒中表达,其活性较原核表达有明显提高,达到2800μ/mg。为利用家蚕生物反应器生产该蛋白提供了依据。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人瘦素蛋白

瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。