Ca2+,Mn2+等8种金属离子对软腐欧文氏菌一些致病因子的影响

 在离体试验中,不同金属离子对马铃薯软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株StEcc-12生长,产生胞外酶和胞外酶活性具有不同的影响。在含果胶酸钠的培养液中,Ca²⁺促进生长,并使培养液中的果胶裂解酶(PL)、果胶水解酶(PG)和蛋白酶3种胞外酶分别提高1.4~23.4倍,0.3~2.9倍和0.7~6.5倍。Mn²⁺对StEcc-12生长及产生3种胞外酶的影响与Ca²⁺相似。Ni²⁺显著抑制细菌的生长,但在含Ni²⁺培养液中3种胞外酶的单位活性比对照高1.7倍以上。在酶粗提液中分别加入上述3种离子对PL酶的活性均有抑制作用。Zn²⁺对细菌生长没有显著影响,高浓度Al³⁺抑制细菌生长,这2种离子均能促进3种胞外酶的产生。随着Fe²⁺和K⁺浓度的增高,细菌生长减少,两种果胶酶产量降低,蛋白酶产量增加,粗提液中PL酶活性下降。Mg²⁺对细菌生长和胞外PG产生没有明显影响,提高Mg²⁺浓度有利于PL的产生。酶粗提液中加入Mg²⁺后PL活性增高。所有以上离子都能使聚半乳糖醛酸发生不同程度的凝聚,但只有Ca²⁺和Mg²⁺的有效凝聚浓度与薯块的实际浓度接近。     

ANEPⅢ毒蛋白的表达调控及其抗虫效果的生物测定

蝎体内产生一系列毒素蛋白,ANEPⅢ是其中一种。试验构建重组表达载体pPIC9K-ANEPⅢ,将质粒pNJUTRXA-ANEPⅢ转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导目标蛋白ANEPⅢ,并用Tricine-SDS-PAGE电泳进行定性分析,检测得到8000 kD目的蛋白。通过电转化的方法将pPIC9K-ANEPⅢ转入毕赤酵母宿主菌GS115中,筛选得到一株耐受2.0 mg/mL G418表型为His⁺Mut⁺的菌株。经0.5%的甲醇诱导,取不同诱导时间的表达上清液进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析,确认7800 kD毒性目的蛋白已经获得分泌表达,在诱导72 h时表达量最高。对ANEPⅢ基因的原核与真核表达产物进行提取、初步纯化后进行了抗虫试验。结果表明,原核表达产物没有显示出生物活性,真核表达产物具有较好的生物学活性。浓度为1 mg/mL的真核表达产物,喂食舞毒蛾2龄幼虫5 d后,校正死亡率达37.9%,幼虫食叶量下降50%。黄粉虫的生物测定结果表明,喂食1 mg/mL的真核表达产物5 d后,黄粉虫幼虫的校正死亡率为20%。     

条锈菌效应子Pst30抑制植物的胼胝质和活性氧积累

 条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst)导致的小麦条锈病严重威胁着我国的小麦生产安全。解析病菌的致病机理,对开发病害防控技术与策略具有重要的指导意义。研究发现效应子是病菌重要的致病因子,揭示效应子调控寄主免疫机制可加深对病菌的认知。本课题组前期在全基因组筛选条锈菌效应子中获得了一个候选效应子基因Pst30,该基因所编码的蛋白N-端含有分泌肽,无明显功能结构域。qRT-PCR分析显示Pst30在条锈菌侵染小麦后12 h诱导表达,72 h诱导表达至高峰。利用农杆菌侵染在烟草中瞬时表达Pst30^ΔSP-GFP融合蛋白,发现Pst30^ΔSP定位在细胞质。在烟草中瞬时表达该效应子能够显著抑制Bax诱导的细胞坏死。利用细菌的Ⅲ型分泌系统在小麦中瞬时表达Pst30,能够抑制荧光假单胞杆菌引起的胼胝质积累,导致由无毒性条锈菌小种CYR23引起的小麦过敏性坏死面积和活性氧积累减少,菌丝面积和长度增加。推测小麦条锈菌效应子Pst30可抑制寄主植物的PTI(PAMP-triggered immunity, PTI)和ETI(Effectors-triggered immunity, ETI),促进自身的侵染。     

基于原生质体转化的甘蔗梢腐病菌YN41基因敲除体系的构建

基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段,为了深入研究甘蔗梢腐病菌致病基因的功能,构建了梢腐病菌YN41菌株的基因敲除体系。本研究构建了基于线性DNA的同源重组基因敲除技术,融合PCR构建敲除盒即带有潮霉素基因标记的线性DNA融合片段,配置0.05 g·mL^-1溶壁酶+0.01 g·mL^-1崩溃酶的复合酶液28℃酶解3 h获得了高产量的原生质体,利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体的转化,PCR鉴定技术和酶切鉴定技术对转化子进行鉴定,荧光定量PCR分析和Southern Blot方法进一步对基因缺失突变体进行验证,生物学表型(菌落形态、生长速率、产孢量、生物量和致病力)验证了PK基因敲除体系的成功构建。28℃酶解3 h获得了2×10⁷个·mL^-1原生质体;对编码丙酮酸激酶的PK基因进行了基因敲除验证,获得了纯合敲除突变体;荧光定量PCR检测转录水平无表达;Southern Blot结果显示使用PK基因探针杂交,基因缺失突变体无条带,野生型杂交到目的条带;生物学表型验证了PK基因敲除突变体对比野生型...     

稻瘟病菌不同小种菌株间无性重组的研究

 将分别携带抗稻瘟灵对多菌灵敏感(MBC^sIPT^r)标记与携带抗多菌灵对稻瘟灵敏感(MBC^rIPT^s)标记的稻瘟病菌营养体亲和的不同小种菌株在白米玫瑰红培养基上,25℃、黑暗中对峙培养18d,配对菌株菌落交界处出现肉眼可见的菌丝融合带。4个小种间营养体可亲和菌株配对组合是:PO21-MBC^r-27(ZA₄₉)×PO3-IPT^r-54(ZF₁)、PO21-MBC^r-27(ZA₄₉)×PO2-IPT^r-51(ZF₁)、PO21-MBC^r-27(ZA₄₉)×PO33-IPT^r-69(ZD₁)和PO21-MBC^r-41(ZA₄₉)×PO3-IPT^r-54(ZF₁)。分别切取各配对组合产生的菌丝融合带,分别建立单菌丝片段群体,测定其对稻瘟灵、多菌灵的抗药性。结果是,从4个配对组合的单菌丝片段后代中,均检测到分别携带MBC^sIPT^r、MBC^rIPT^s标记和同时携带双亲抗性标记(MBC^rIPT^r)3种个体,其中MBC^rIPT^r个体的检出率为1.0%~3.6%。无性重组体的MBC^r和IPT^r性状在其菌丝块移植继代培养和单菌丝片段株后代发生分离。以配对组合PO21-MBC^r-27×PO3-IPT^r-54产生的菌丝融合带建立单孢无性系,从3178个单孢株中筛选到4株MBC^rIPT^r个体,其MBC^rIPT^r性状在单孢后代和单芽管分离株后代均能稳定遗传。结果表明,营养体亲和的稻瘟病菌不同小种菌株之间可通过菌丝融合产生无性重组体,同时提示无性重组体内可能发生了准性生殖。     

一株PVYNTN-NW黑龙江马铃薯分离物的检测鉴定

 马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯、烟草等茄科作物上的重要病毒,在与寄主共同进化过程中产生了许多株系。本文从黑龙江马铃薯样品中得到PVY分离物A12。ELISA结果表明A12被PVY^O的单克隆抗体特异性识别。A12开放阅读框为9 186个核苷酸,编码3 061个氨基酸,与SYR-II-Be1分离物的核苷酸和氨基酸序列一致率均最高,分别为98.3%和99.2%。系统发育分析发现A12与PVY^NTN-NW株系SYR-II型的分离物聚类到一起;重组分析表明,A12是N-605和O_z的重组体,重组类型与SYR-II-Be1相同。综合以上结果表明,A12属于PVY^NTN-NW株系SYR-II型。但与常见PVY^NTN-NW株系分离物在珊西烟引起叶脉坏死不同,A12产生花叶症状。A12辅助成分-蛋白酶在182位和245位的氨基酸均为精氨酸,而其它PVY^NTN-NW株系分离物为赖氨酸。本研究结果可为黑龙江马铃薯PVY的早期检测和有效防控提供理论指导。     

一株PVYNTN-NW黑龙江马铃薯分离物的检测鉴定

 马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯、烟草等茄科作物上的重要病毒,在与寄主共同进化过程中产生了许多株系。本文从黑龙江马铃薯样品中得到PVY分离物A12。ELISA结果表明A12被PVY^O的单克隆抗体特异性识别。A12开放阅读框为9 186个核苷酸,编码3 061个氨基酸,与SYR-II-Be1分离物的核苷酸和氨基酸序列一致率均最高,分别为98.3%和99.2%。系统发育分析发现A12与PVY^NTN-NW株系SYR-II型的分离物聚类到一起;重组分析表明,A12是N-605和O_z的重组体,重组类型与SYR-II-Be1相同。综合以上结果表明,A12属于PVY^NTN-NW株系SYR-II型。但与常见PVY^NTN-NW株系分离物在珊西烟引起叶脉坏死不同,A12产生花叶症状。A12辅助成分-蛋白酶在182位和245位的氨基酸均为精氨酸,而其它PVY^NTN-NW株系分离物为赖氨酸。本研究结果可为黑龙江马铃薯PVY的早期检测和有效防控提供理论指导。     

草酸诱导黄瓜抗炭疽病的机理研究

 本文进一步证明草酸能显著诱导黄瓜对炭疽病的系统抗性,同时发现硫酸亚铁亦具有显著的诱抗效果。草酸能诱导局部叶片及系统叶片中壁共价键结合态、壁离子键结合态和可溶态过氧化物酶(POD)活性提高,其中离子键结合态POD活性提高量最大,共价键结合态POD活性提高倍数最大。草酸处理后还原型抗坏血酸(AsA)与氧化型抗坏血酸(DHAsA)的比值和亚铁离子(Fe²⁺)与三价铁离子(Fe³⁺)的比值均明显增加。对壁结合态POD、Fe²⁺、As A在草酸诱导抗病性中的作用进行了较深入的讨论。     

H2O2、NO和Ca2+参与疫病菌激发子PB90诱导烟草气孔的关闭

 本文研究了过氧化氢(H₂O₂)、一氧化氮(NO)和Ca²⁺在棉疫病菌激发子PB90诱导烟草气孔运动中的作用。1 nmol/L激发子PB90可诱导野生型烟草Bel-W3气孔关闭,且在相同条件下该激发子诱导反义抑制抗坏血酸过氧化物酶anti-APX烟草气孔关闭的孔径比野生型的更小;进一步药理学证明,抗氧化剂DTT和NADPH氧化酶抑制剂DPI(diphenylene iodonium)、一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME、Ca²⁺螯合剂EGTA和Ca²⁺信号途径中CaMPK Ⅱ的竞争抑制剂KN93与磷脂酶C抑制剂U73122都能抵消PB90诱导气孔关闭的效应。推测该激发子PB90通过NADPH氧化酶途径形成H₂O₂、NOS途径形成NO和Ca²⁺信号途径进而诱导气孔关闭。表明H₂O₂、NO、Ca²⁺在激发子PB90诱导气孔关闭信号传递中作为第二信使起着重要的作用。     

钙信使系统参与草酸对湖北海棠POD活性的诱导

 以EGTA、异博定(Ver)、氯丙嗪(CPZ)和Li⁺处理湖北海棠叶片,考察了钙信使系统在草酸诱导过氧化物酶(POD)中的作用。结果显示,4种抑制剂分别与草酸同时或先于草酸处理时,均明显抑制草酸对叶片POD总活性的诱导,表明Ca²⁺、Ca²⁺通道、钙调素(CaM)和磷酸肌醇均可能参与了草酸对POD的诱导。此外,草酸处理后一定时间再用抑制剂处理,也能够抑制草酸对POD的诱导作用。EGTA和Ver在草酸处理8h后应用的效果低于4h后应用;CPZ和Li⁺在草酸处理后4或8h应用,效果相近。     

马铃薯Y病毒N株系HC-Pro基因在毕赤酵母中分泌表达与鉴定

 以克隆载体pGEMT-PVY-NHC为模板,用PCR方法获得HC-Pro基因,构建表达载体pPIC9K-HC,将重组质粒经Sal I单酶切后电转化Pachia pichia GS115菌株,筛选出对G418有高抗性和在MM培养基上生长缓慢的转化子。经摇瓶发酵和1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵液上清,在66 kD处有1个特异条带表达,目的条带蛋白占上清液总蛋白的40%。Western blot鉴定表明,表达蛋白可以和HC抗体发生结合反应。     

纤细齿梗孢丝氨酸蛋白酶cDNA克隆及其序列分析和表达

纤细齿梗孢Olpitrichum tenellum是一种寄生在轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides上的活体营养菌寄生真菌。丝氨酸蛋白酶在菌寄生过程可能起到重要作用。根据丝状真菌丝氨酸蛋白酶的同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE的方法,克隆得到1845bp的全长cDNA片段。其可读框为1554bp（GenBank登录号为EU368754）,编码517个氨基酸的蛋白质。比对分析发现该蛋白是一种分泌型的丝氨酸蛋白酶,属于丝氨酸蛋白酶S8家族的枯草杆菌蛋白酶subtilisin,具有典型的信号肽-前肽-成熟肽的结构。将该基因可读框除去信号肽插入酵母表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115,在甲醇诱导下成功分泌出具有生物活性的重组蛋白酶,诱导120h后酶活性可达153U/ml。重组蛋白酶经DEAE-Sepharose层析进行纯化,SDS-PAGE分析其分子量为39kD。其反应的最适温度为60℃,最适pH为8。     

泡桐丛枝植原体pPaWBNy-1-ORF5编码蛋白的原核表达和抗体制备

 利用含泡桐丛枝植原体质粒pPaWBNy-1的3.0 kb片段的克隆为模板,PCR扩增pPaWBNy-1-ORF5的亲水性肽段编码区。目的片段连接到原核表达载体pET28a(+),重组质粒pET28a-ORF5-5转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosseta (DE3)感受态细胞,菌液处在对数生长期时(OD₆₀₀=0.52),添加IPTG诱导5 h后收集菌体,提取蛋白并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。用六聚组氨酸标签抗体进行Western blot检测,发现分子量约为15 kDa的含多聚组氨酸标签的目的蛋白得到表达。切胶回收融合蛋白,免疫德国大白兔以制备抗血清,间接ELISA法测定抗血清的效价约为1∶8 100。用制备的ORF5编码蛋白的抗血清进行Western blot分析,结果在带菌的介体昆虫茶翅蝽(Halyomorpha halys)中检测到大小约为17 kDa的特异蛋白条带,但在健康和感病泡桐(Paulownia sp.)及无菌茶翅蝽中均未检测到,由此推测pPaWBNy-1-ORF5蛋白与介体昆虫传播植原体有关。     

真核表达产物Y3诱导烟草对烟草花叶病毒的抗性研究

从毛头鬼伞Coprinus comatus中提取的碱性糖蛋白Y3可以降低烟草花叶病毒(TMV)的侵染.克隆获得Y3蛋白cDNA后与真核表达载体pPIC-9k连接,重组载体pPIC-9k-Y3成功电转化入毕赤酵母Pichia pastoris后,转化子在28℃、250 r/min培养条件下,使用1.0％甲醇诱导表达6d,...     

利用蝎毒基因改良杆状病毒杀虫剂

杆状病毒(Baculovirus)是昆虫及某些甲壳类动物的专性病原体,昆虫杆状病毒杀虫剂是公认的一类无公害的生物农药,联合国世界卫生组织(WHO)和粮农组织(FAO)早已推荐用于农作物害虫生物防治。但是,杆状病毒都有一个共同的缺点,就是杀死害虫时间太长(一般室内需要5—7天,田间需要时间更长)。由于这一缺点,使杆状病毒杀虫剂的商品生产和推广应用受到很大限制,甚至停滞不前。 本研究通过人工合成一种对昆虫专性的蝎子Androctonus anstralis神经毒素AaIT的编     

水稻条纹病毒NS2基因原核表达产物多克隆抗体制备及受侵染水稻和灰飞虱体内NS2检测

 The NS2 gene of Rice stripe virus (RSV) was amplified by RT-PCR, cloned into pGEM-T vector and sequenced. The NS2 gene was inserted into prokaryotic expression vector pET32a to produce recombinant plasmid pET32a-NS2. The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain BL21 (DE3) pLysS. SDS-PAGE and Western blot analysis confirmed that NS2 fusion protein was expressed after induction by IPTG. The recombinant NS2 protein was purified with Ni²⁺-NTA agarose affinity chromatography and the polyclonal antibody against NS2 protein was raised in rabbit. NS2 protein was successfully detected in small brown planthopper (Laodelphax striatellus) at 1:1 600 dilution of the total protein of single planthopper and in infected rice (Oryza sativa) at 1:800 dilution of 10 mg leave by dot immunobinding assay using the polyclonal antibody.     

产harpin的成团泛菌工程菌的构建

 梨火疫病菌(Erwinia amylovora)产生的胞外蛋白harpin是引发其非寄主植物过敏反应的因子。harpin蛋白还具有诱导植物抗性的功能。成团泛菌(Pantoea agglomerans)308R对链格胞属(Alternaria)的真菌具有拮抗活性,是一株抗利福霉素的自发突变株,对壮观霉素敏感。本文通过电击转化法将带有梨火疫病菌hrp基因簇的重组质粒pCPP430导入308R。所得转化子具有pCPP430的壮观霉素抗药性标记,在番茄上引起过敏反应;从转化子中提取到与pCPP430大小一样的质粒,其酶切物理图谱也与pCPP430完全相同;用地高辛标记的harpin的结构基因hrpN为探针对转化子中的质粒进行Southern blotting分析,结果在转化子中得到信号明显的杂交片段,而受体菌308R中未出现杂交信号;提取细菌的外壁的蛋白质进行PAGE分析,在大约44 kd的位置上308R(pCPP430)比308R明显多出1条带。这些结果表明成团泛菌能够表达梨火疫病菌的hrp基因簇,所产harpin蛋白也是有活性的。     

青稞散黑穗病拮抗菌LN-176的分离鉴定、发酵条件及发酵产物的研究

从西藏佩古错湖湖边的土壤中分离到一株对青稞散黑穗病菌具有较强抑制作用的细菌,经鉴定为多粘芽孢杆菌,命名为LN-176。该菌株对多种植物病原真菌、部分革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌有较好的拮抗作用。以10%的接种量将该菌接种到初始pH7.0的发酵培养基中,28℃旋转培养,发酵液在84h时抗菌活性达到最高,且具有较好的热稳定性和pH稳定性,对蛋白酶K有一定的耐受性。LN-176菌株的发酵液在260nm和280nm下进行吸光度测定,结果表明发酵液中蛋白质含量明显升高;发酵液经硫酸铵盐析后,取上清液和沉淀物分别做抗菌试验,发现沉淀物对青稞散黑穗病菌有拮抗活性而上清液无活性。     

绿木霉Sm1基因的克隆、原核表达及蛋白纯化

木霉菌(Trichoderma spp.)是土壤内普遍存在的习居菌,具有多种生物防治功能,其中诱导植物免疫反应是重要的生物防治功能之一[1].木霉菌Sm1蛋白(small one protein)是从绿木霉(Trichoderma virens)中分离得到的一种低分子量、富含半胱氨酸的疏水性蛋白,属于蛋白类激发子,与Cerato-platanin基因家族有很高的同源性,具有诱导植物免疫抗性的作用[2].