一种新的杆状病毒转移载体的构建

从家蚕核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒中分别克隆出其Ｐ１０基因。从ＢｍＮＰＶＰ１０中亚克隆得到基５端上游片段，经ＰＣＲ定位突变使之ＡＴＧ区突变成一个Ｂｇ１Ⅱ酶切位点。从ＡｃＭＮＰＶＰ１０中亚克隆得到基因３端下游片段，克隆人经突变的ＢｍＮＰＶＰ１０基因启动子的下游，构建成一个新的转移表达载体ｐＢｍＡｃＰＶ－１，由于ＢｍＮＰＶ和ＡｃＭＮＰＶＰ１０基因及两端的同源性高达９０％以上，     

AcMNPV LEF-10第21位突变对其活性的影响

[目的]对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子LEF-10的第21位保守氨基酸残基进行饱和点突变,研究该位点突变对AcMNPV活性的影响,为进一步研究LEF-10朊病毒特性及其在病毒复制中的作用奠定基础.[方法]同源序列比对发现,LEF-10第21位亮氨酸残基高度保守.对pTriEx质粒载体上LEF-...     

AcNPV对甜菜夜蛾二龄幼虫的生物测定

以甜菜夜蛾二龄幼虫对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）两种毒株采用生物测定方法进行比较。对AcNPV两毒株杀虫毒力及杀虫速率的分析表明：以甜菜夜蛾活体增殖的ACNPVA株（LD(50)=131．8PIB／头）比用草地贪夜蛾细胞株（Sf9）增殖的AcNPVB株（LD(50)=1696．8PIB／头）毒力要高10倍,而毒杀速率,也以AcNPVA株（LT(50)=4．46d）比AcNPVB株（LT(50)=6．57d）快1．5倍。     

复合型甘蓝夜蛾核型多角体病毒对三种夜蛾的室内毒杀试验

复合型甘蓝夜蛾核型多角体病毒是由甘蓝夜蛾核型多角体病毒(MbNPV)与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(ACNPV)按0.5∶1复合而成的。为了掌握其对甘蓝夜蛾的毒杀效果,用蒸馏水将其稀释成2.0×10~3、2.0×10~4、2.0×10~5、2.0×10~6、2.0×10~7PIB·mL~(-1)五个所需的浓度进行测试,并用方差分析和新复极差法测验。结果表明:复合型甘蓝夜蛾核型多角体病毒对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、甘蓝夜蛾毒杀效果差异显著。饲毒后第2天,甘蓝夜蛾对复合剂较敏感;饲毒后第3天对复合剂敏感性均增强;饲毒后第4天,甘蓝夜蛾、甜菜夜蛾死亡率均在80%以上,斜纹夜蛾死亡率在60%以上。     

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)增殖条件研究

试验研究表明：32℃温度条件下增殖病毒多角体的生产效率最高,以甜菜夜蛾为宿主,5龄幼虫是最适宜的喂毒时期,较低的喂毒剂量可以减少毒源多角体的消耗。5龄、32℃和105～106PIB·ml-1处理组合每头供试幼虫平均日产AcMN－PV多角体可达（2．30～2．32）×108个     

多角体病毒琼脂免疫双扩散和ELISA检测研究

用提纯的SpltNPV、AcNPV病毒粒子分别为免疫抗原获得抗血清,以此抗血清为抗体,提纯的SpltNPV、AcNPV多角体裂解所得粗提纯病毒粒子为检测抗原,初步建立两种病毒的琼脂免疫双扩散法和ELISA间接检测方法.琼脂免疫双扩散结果表明：所得抗血清能识别粗提抗原,但不能与细胞培养的病毒粒子反应.两种病毒I-ELISA检测灵敏度分别达11.23、11.67 ng.     

米满对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的增效作用研究

研究了以甜菜夜蛾为靶标害虫时,米满对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的作用效果。结果表明,在作用于甜菜夜蛾幼虫时,6.67mg/kg米满对AcNPV有显著增效作用,其增效作用表现为增加杀虫毒力和提高杀虫速度,可使病毒对3龄和4龄幼虫的毒力分别提高0.31倍和2.62倍,杀虫速度分别提高10.9%和6.9%,使总杀虫速度提高25%和20.4%。     

米满对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒关于幼虫生长发育及羽化成虫后繁殖力的增效作用

研究了以甜菜夜蛾为靶标害虫时,米满对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的作用效果。结果表明,米满对病毒协同作用显著抑制了幼虫的生长发育,幼虫体重增长明显低于单用病毒;联合处理的存活幼虫羽化为成虫后,交配率、产卵量、卵孵率等均与对照无显著差异。     

蛇床子素对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的增效作用

为寻找病毒增效新途径,克服天然昆虫病毒存在杀虫活性低和速度慢的缺陷,研究植物源提取物蛇床子素对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的增效作用.结果表明,以甜菜夜蛾为靶标害虫时,蛇床子素在作用于甜菜夜蛾幼虫时对AcNPV有显著增效作用,但对病毒杀虫速度无明显提高作用.蛇床子素在作用于甜菜夜蛾成虫时有效降低其繁殖力,取食含AcNPV和蛇床子素糖水的甜菜夜蛾产有效卵数量显著低于单取食含AcNPV糖水甜菜夜蛾的有效卵量.     

苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒对甜菜夜蛾幼虫及成虫的影响

分别研究了甜菜夜蛾在幼虫期和成虫期对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒 (AcNPV)的敏感性。结果表明,AcNPV对 4龄甜菜夜蛾幼虫的致死中浓度为 1ml9 1×106 PIB(多角体), 4龄幼虫摄入亚致死剂量病毒对化蛹产生不良影响,并使性比发生变化,雌雄蛹比为 0 6~0 8,较对照明显升高;幼虫期摄入病毒亦对其成虫的繁殖力产生影响,无论是每雌产卵量、总卵量还是卵孵化率均比对照显著降低,交配比例和次数也比对照明显下降。甜菜夜蛾成虫期摄入病毒亦对繁殖力产生影响,产卵量和交配比例和次数以及卵孵率均比对照明显下降,此外,还对后代幼虫的存活率有显著影响。     

应用昆虫杆状病毒载体在昆虫细胞中表达乙肝表面抗原

人乙型肝炎病毒（ａｄｒ亚型）表面抗原Ｓ基因克隆到ＰｕＡＣ－５苜蓿尺蠖核型多角体病毒转移载体上，所构建的重组转移载体质粒与野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ共转染Ｓｆ－２１细胞，经空斑法筛选和纯化，得到了含ＨＢＶＳ基因的重组病毒ＡｃＮＰＶＳ．用放射免疫法测定了ＡｃＮＰＶＳ感染的Ｓｆ－２１细胞及其培养液中的ＨＢｓＡｇ，总表达量为１．２２μｇ／１０￣６细胞．     

异源多角体蛋白包装对重组家蚕核型多角体病毒感染性的影响

 将 Ac MNPV的 polh基因克隆到缺失 polh基因的 Bm NPV(API4)基因组中 ,得到被 Ac MNPV多角体蛋白包埋并可表达慈菇蛋白酶抑制剂的重组病毒 Bm NPV(OAc- API4)。发现它的芽生型病毒能感染家蚕细胞和经皮下注射感染家蚕幼虫 ,但包埋型病毒不能经口感染家蚕幼虫。     

RSV编码的4种蛋白在“AcMNPV-sf9昆虫细胞”体系中的重组表达

应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的4个基因NS2、NS3、CP和SP,并将它们克隆至pMD-18-T载体上.得到的重组质粒pMD-18-T-NS2、pMD-18-T-NS3、pMD-18-T-CP和pMD-18-T-SP经XbaⅠ/HindⅢ双酶切,分别与经相同方法酶切的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california nuclear polyhedrosis virus,AcM-NPV)转移载体pFastBacHTb相连接,构建重组转移质粒pFastBacHTb-X(pFastBacHTb-NS2、pFastBacHTb-NS3、pFastBacHTb-CP和pFastBacHTb-SP).序列测定表明,目的基因准确地插入到表达载体中.重组质粒pFastBacHTb-X通过转化包含有穿梭载体的大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH10Bac,得到重组穿梭质粒rb-X(rb-NS2、rb-NS3、rb-CP和rb-SP).rb-X侵染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)离体细胞(sf9)24-72 h后,在荧光倒置显微镜可见光200倍视野下观察到细胞增大、培养液和细胞内出现颗粒状物质、部分细胞破裂甚至裂解等一系列与正常sf9细胞形态有明显区别的现象.rb-X侵染细胞72h后,从细胞提取蛋白,电泳分析得到4个条带,大小分别为28.2、29.2、40.2和25.2 ku,与预测的4种融合蛋白大小一致.Western blotting分析分别得到4条单一条带,证明了RSV NS2、NS3、CP和SP基因在"AcMNPV-sf9昆虫细胞"真核表达体系中成功表达.     

家蚕核多角体病毒Lef—1和DA26基因的克隆及部分序列分析

ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因分别位于ｅｇｔ基因的上游和下游．从ｐＵＡｃ－ｅｇｔ中分离出ＥｃｏＲＩ－ＸｂａＩ１．１ｋｂ的ｅｇｔ基因片段，进行缺口平移标记，获得探针。与ＢｍＮＰＶＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ酶切、电泳、转移至ＮＣ膜的ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交，发现ＢｍＮＰＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢＤ片段呈阳性。从ＢｍＮＰＶ基因组中分离出１０．４ｋｂ的ＨｉｎｄⅢＤ片段，用ＥｃｏＲＩ酶切得到ＨｉｎｄⅢ－ＥｃｏＲＩ２．２ｋｂ、ＥｃｏＲＩ１．４ｋｂ和ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ６．８ｋｂ３个片段，分别克隆于ｐＵＣ１９中，命名为ｐＵＨＥ２．２、ｐＵＥ１．４和ｐＵＥＨ６．８。经双链测序并与ＡｃＮＰＶ相关基因序列进行比较，发现ｌｅｆ－１基因被克隆于ｐＵＨＥ２．２中，ＤＡ２６基因克隆于ｐＵＥＨ６．８中。从所测定的ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因的启动子及５＇端部分序列来看，它们在ＡｃＮＰＶ和ＢｍＮＰＶ之间有极高的同源性。     

茶尺蠖NPV对茶尺蠖幼虫取食及生长发育的影响

喂饲茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)后,茶尺蠖幼虫的总食量极显著下降。1、2龄初饲毒,减少90.99～99.39％;3、4、5龄初饲毒,减少47.24～54.18％。总食量减少的主要原因是取食速率的显著减缓。1龄初饲毒,总取食期极显著缩短;2、5龄初饲毒,与对照无显著差异;3、4龄初饲毒,则总取食期极显著延长。各龄初饲毒后,该龄和下几龄的历期一般都极显著延长。饲毒后,幼虫体重明显减轻,能化蛹的蛹重也显著下降,但蛹历期和成虫寿命不受影响,上述结果表明,以EoNPV防治茶尺蠖幼虫宜在2龄初或其以前应用。在3龄初及其以后饲毒,高温条件下虽然幼虫死亡率不高,但总食量明显下降,仍有一定的效果。     

水稻瘤矮病毒S3和S8基因共表达杆状病毒转移载体构建及重组病毒的鉴定

为构建携带水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)主要内层衣壳蛋白S3基因和外层衣壳蛋白S8基因的重组杆状病毒,将目的基因(S3和S8)分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子(PH)和p10启动子的下游.经酶切和确证性序列测定,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,...     

AcMNPV-1A在转P35基因细胞系中连续传代的研究

报道了1株粉纹夜蛾转P35基因工程细胞系,命名为Tn5B-35。苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Au-tographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus,AcMNPV)在该细胞系中连续传代至25代,与原始细胞系Tn5B1-4相比较,其感染率、多角体产量、滴度以及杀虫毒力的变化趋势均比较平稳,并未出现"传代效应"。     

温度对茶尺蠖核型多角体病毒形态发生的影响

电镜观察结果表明,26℃下茶尺蠖核型多角体病毒形态发生正常,其过程可分成病毒发生基质的形成—核衣壳的形成—病毒粒子的形成—多角体成熟四个阶段,一个细胞核切面可见1～50,甚至更多的多角体,30℃下则其形态发生受阻,开始饲毒后168小时内,宿主中肠上皮细胞和脂肪体细胞核中均未见病毒有关结构,仅观察到染色质凝集块,这应是高温季节该病毒防治效果差的重要原因之一。 此外,在26℃下饲毒所得宿主细胞切片中,还观察到了核内的大量管状物,特长病毒粒子及内含纤维物的具双层膜的囊状物,核内和细胞质中具侧膜的成束纤维状物等特殊结构。