微量提取法提取茵陈总黄酮的工艺研究

以微量提取法提取茵陈中黄酮类化合物,用紫外-可见比色法和芦丁为标准品测定茵陈总黄酮的得率,在单因素试验的基础上,设计L9(34)正交试验。结果表明,影响微量提取法提取茵陈总黄酮类的主次因素为:料液比提取时间提取温度;最佳提取工艺条件为:料液比1∶30(g/mL),提取时间30 min,提取温度60℃,茵陈中总黄酮得率为4.20%。     

新城疫不同宿主源分离株的生物学特性

选择6株(鹅DC01、鸡WJ10001、鸽DZ01、鸽DZ02、鸭NJ10、鸭SD09)分离自鸡、番鸭、鹅、鸽的新城疫病毒,接种于10日龄无特定病原体(SPF)鸡胚中,通过测定鸡胚平均死亡时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)及融合蛋白(F)裂解位点氨基酸序列,研究其生物学特性和分子流行病学特征.结果显示,6个分离毒株均为新城疫病毒(NDV)强毒株.对F基因的序列测定和遗传关系分析表明,2株鸭源NDV强毒株(鸭NJ10、鸭SD09)与1株鸭源NDV山东流行毒株(鸭SDWF2005)高度同源;2株鸽源NDV强毒株(鸽DZ01、鸽DZ02)与1株鸽源DNA强毒株(鸽JS2000)高度同源.6株不同宿主源毒株的基因型分别为Ⅵ型和Ⅶ型,是中国目前流行的NDV毒株型.     

烟草花叶病毒弱毒株的筛选及其交互保护作用

采用高温、亚硝酸及两者的复合处理对烟草花叶病毒 (TMV)强毒株进行诱变 ,均可有效提高突变频率 ,而且复合处理还有较好的协同效应 .经生物学接种鉴定及血清学方法筛选 ,从中获得了 TMV- 0 17和TMV- 15 2 2个弱毒株 .用正交设计法考察病毒接种浓度、接种间隔时间、接种部位以及普通烟生育期等因素对弱毒株交互保护作用的影响 ,发现以烟株生育期和接种间隔时间两因素影响最大 .本试验结果表明 ,在烟草团棵期 ,弱毒株和强毒株接种间隔时间为 17d时 ,交互保护作用效果最好     

马铃薯X病毒云南分离物单克隆抗体的制备及其检测应用

用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗PVX单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞2B12和4E7,并分别制备它们的单抗腹水.2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价在10-6以上,2B12和4E7的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链.利用这些单克隆抗体建立了抗原包被的间接ELISA(ACP-ELISA)检测PVX的方法.病叶经1:600倍稀释、提纯PVX病毒浓度为2 ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.2 ng)时,该方法仍能检测到病毒.利用ACP-ELISA方法测定了田间样品,发现PVX在马铃薯上发病很普遍.     

苹果茎沟病毒的分离纯化及血清学检测

 从苹果样品中分离到苹果茎沟病毒（ASGV）,汁液摩擦接种该病毒可侵染昆诺藜（Chenopodium quinoa）、苋色藜（C.amaranticolor）、心叶烟（Nicotiana glutinosa）、灰藜（C.niurale）、菜豆（Phaseolus vulgaris "pinto"）和西方烟（N.accidentalis"37B"）。在昆诺藜叶片汁液中,该病毒体外存活期为3d左右（25℃）,热钝化点60～65℃（10min）,稀释限点10#+(-4)。提纯病毒在-20℃下,存活期为6个月以上。提纯病毒液A260/A280=1.18。病毒粒子呈线状,大小为620～680nm×11～12nm。衣壳蛋白分子量为31.0kD。用提纯病毒免疫大耳白兔,所获抗血清用于检测提纯病毒样品和感染ASGV的昆诺藜叶片,其效价毛细管微量沉淀反应法为1:512,酶联免疫吸附法为1:10#+4以上。用该抗血清可检测出感染ASGV的苹果试管苗和田间生长植株叶片。     

连续变温处理整体病株诱变烟草花叶病毒弱毒株的研究

烟草花叶病毒(TMV)的弱毒株SA-10是用变温处理心叶烟(Nicotiana glutihosa)病株而得到的。其诱变程序:常温(25℃)和高温(30—35℃)交替处理病株返复十次。以“三生”烟(N.tabacum CV.Samsun)上的症状轻重来鉴别致弱程度,以心叶烟叶碟上的枯斑数测定病毒的浓度。SA-10弱毒株在“三生”烟上无症状,增殖浓度低于烟草花叶病毒普通株(TMV-O),失毒温度90℃,稀释限点10~(-7)—10~(-8),血清反应与TMV-O相同。可干扰TMV-O的增殖。     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒提纯和抗血清制备

采用PEG沉淀并结合差速离心技术,获得了精提纯的侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV-Li).提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线.OD260 nm/OD280 nm=1.236.将提纯病毒免疫兔子制备得CMV-Li抗血清.经微量沉淀法和间接ELISA法测定,其效价分别为1∶1024、1∶4096.两种方法相比,间接ELISA具有灵敏度高、特异反应强等优点.     

大豆的烟草环斑病毒提纯、抗血清制备和蛋白质A—琼脂糖CL-4B柱层析纯化抗血清的研究

大豆的烟草环斑病毒(TRSV)在温室里按种繁殖于黄瓜(Cucumis Saliva cv.SelectedNational)苗上,分批接种和采收,榨取病毒汁液。用差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯,每批提纯程序一致和植株生长繁殖日数大致相同,但仍存在一些人为的差异。提纯后最高病毒浓度为12.20毫克/毫升,但一般多为2.78～4.54毫克/毫升。子叶开展后第2天接种,经12日左右收获的材料提纯病毒收量最高。蔗糖密度梯度离心对本病毒的提纯效果很好。家兔免疫注射每次用0.5毫克/毫升浓度的提纯 TRSV 收得较好的抗血清,提高剂量并未能增高抗血清的效价。蛋白质 A-琼脂糖 CL-4B 亲和性柱层析是一项先进技术,对纯化抗血清起到显著作用。由于抗血清的精提纯,要滤去一些杂质,经此柱层析纯化后,纯化的抗血清约为原量的25.27%。这种抗 TRSV—IgG 灵敏度高,用量很少,适于 ELlSA 研究之用。     

茶毛虫核型多角体病毒毒株分化对病毒增殖和毒效的影响

为明确茶毛虫核型多角体病毒(EpNPV)毒株分化对病毒增殖和毒效的影响,分别采用室内活体增殖和生物测定的方法,测定了4个EpNPV分离株的病毒增殖产量和EpNPV分离株组合的协同作用.结果表明,4个EpNPV分离株的病毒增殖产量没有显著差异,其中浙江毒株的病毒产量较其他3个毒株略高,病毒产量为48.17×108PIB·g-1.浙江毒株与贵州毒株1:1组合后,协同毒力始终为相加作用;与湖北毒株1:1组合后,前期表现为拮抗作用,后期为相加作用.结论认为,EpNPV毒株分化对病毒增殖和毒效没有不利影响,浙江毒株是室内病毒增殖和田间应用的首选毒株.     

猪繁殖与呼吸综合征类NADC30与HP-PRRSV毒株RT-PCR鉴别方法的建立与应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种能够引起大面积呼吸道疾病并快速传播,导致母猪流产和仔猪死亡的RNA病毒,其特性为变异快,存在毒株间的重组。因此,病原的快速检测和鉴定对于该病的防控十分重要。本试验建立了一种能够区分类高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30与HP-PRRSV毒株的检测方法,根据nsp2基因的高变区的比对结果,选择其保守序列,设计一对检测引物,类NADC30扩增片段大小为334 bp,HP-PRRSV毒株扩增片段大小为514 bp,通过优化反应条件,最终建立了一种一对引物就可以区分检测类NADC30与HP-PRRSV毒株的RT-PCR检测方法。应用本试验所建立的RT-PCR方法对2017年12月至2018年2月采至四川多地区的疑似PRRSV感染发病的46份肺脏进行检测。结果显示,类NADC30检出率为32. 6%,高于HP-PRRSV毒株的检出率(10. 9%)。该方法的建立,为类NADC30和HP-PRRSV毒株的快速鉴别诊断提供了方法,具有重要意义。     

水稻条纹叶枯病的研究 Ⅲ.病害的病原性质

水稻条纹叶枯病系由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)所致.病毒由灰飞虱(Laodelphax striatellus)以持久性方式并经卵传播,介体灰飞虱有明显的间歇传毒现象.提纯病毒制剂具有典型的核蛋白紫外吸收曲线,最大吸收260nm,最小吸收245nm,A260/280=1.54.病毒粒体长丝状,粒体直径约8nm,与日本的水稻条纹病毒抗血清呈阳性反应.将提纯病毒制剂免疫家兔制备抗血清,其效价可达1∶2048.采用该抗血清,通过免疫扩散和ELISA间接法反应,可很灵敏地检测病叶中的RSV.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒抗血清制备及应用

用葫芦[Lagenaria siceraria（Molina）Stand．]作为黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）的繁殖寄主,通过差速离心和PEG二次沉淀法进行病毒提纯,用提纯病毒液免疫新西兰兔制备CGMMV抗血清。制备的CGMMV抗血清经间接ELISA法测定效价为1：5120;利用制备的抗血清检测田间样品,证明其可以用于CGMMV的血清学及免疫捕获RT—PCR检测。研究结果对今后开展葫芦科作物CGMMV检测,及时发现疫情以便采取防控措施,避免病毒扩散为害,确保葫芦科作物的安全生产具有重要意义。     

大蒜茎尖组培苗的检测

从市售阿城紫皮蒜生长的叶片经ＰＥＣ沉淀差速离心提纯,获得复合病毒制剂,得率为４．９０ｍｍ（１００ｇ）－１叶。电镜观察病毒粒体为长度５５０～８００ｎｍ的线状物,经抗血清测定主要为洋葱黄矮病毒（ＯＹＤＶ）和大蒜潜隐病毒（ＧＬＶ）。用复合病毒制剂免疫制备的抗血清效价为１０２４～２０４８。ＯＹＤＶ抗血清检测茎尖脱毒组培苗,脱毒率为５０％左右,用ＧＬＶ抗血清检测,脱毒率为９５％～９７％,复合病毒抗血清检测结果与ＯＹＤＶ相同。证明复合病毒抗血清可用于组培苗的检测。组培脱毒大蒜在田间种植１年后发病率为５０％,３年后达８０％。茎尖组培脱毒率不高。需用抗血清逐株检测挑选,淘汰病苗,才能获得健康无毒的大蒜群体。     

甘蔗花叶病毒的提纯及抗血清制备

以ＳｃＭＶ－Ａ为材料,采用ＰＥＧ沉淀结合差速离心技术,经１０－４０％蔗糖密度梯度离心后再经浓缩后即为提纯病毒制剂。该提纯病毒具有典型的核蛋白吸收曲线,最大紫外吸收值在２５７ｎｍ处,最小紫外吸收值为２４０ｎｍ,Ａ２６０／２８０＝１．６８,病毒产量可达１．２５－１．３７ｍｇ／ｋｇ。将提纯病毒免疫家兔制备抗血清,所制备的抗血清经Ａ蛋白酶联免疫吸附法测定,其效价为１／１０２４,且可用于检测甘蔗花叶病毒。     

侵染唐菖蒲的菜豆黄花叶病毒的初步研究

 从叶片表现为白色斑驳的唐菖蒲病株上分离到一病毒,通过寄主范围测定,可侵染豆科、藜科、苋科、番杏科中的8种植物。病毒的致死温度为50～60 ℃,稀释限点为10^-3～10^-4,体外保毒期为3～4 d。病毒是长度为700～750 nm的线状粒子,血清学反应与标准BYMV抗血清出现明显的沉淀线。可认为该病毒分离物为菜豆黄花叶病毒(Bean Yellow Mosaic Virus, BYMV)。     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒血清学检测方法研究

采用摩擦接种和PEG沉淀法对侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV)进行了提纯,提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线,D260 nm/D280 nm=1.236;利用提纯的CMV免疫大白兔制备抗血清,经微量沉淀法测定,其效价为1∶1024;用硫酸铵沉淀法提纯IgG,制备了辣根过氧化物酶标抗体,利用自制抗血清对DAS-ELISA、间接-ELISA和DIBA-ELISA检测侵染观赏百合的CMV灵敏度和检测范围进行了比较试验,结果表明DAS-ELISA检测的灵敏度较高,是间接-ELISA和DIBA-ELISA灵敏度的4倍;间接-ELISA和DIBA-ELISA的检测范围比DSA-ELISA宽.对21个观赏百合样品的CMV检测结果表明,DIBA-ELISA的检出率为66.67%,间接-ELISA的检出率为38.09%,二者的检出率分别比DAS-ELISA的检出率(23.81%)提高了42.86%和14.28%.     

大豆花叶病毒(SMV)一强株系的若干特性

将从大豆黑农16号分离的毒株SMV-H-16与美国阿肯色州分离的两个毒株SMV-S-6及S-7比较,三毒株的寄主范围基本相同,只系统侵染大豆,在几个菜豆品种上形成局部斑.H-16局部侵染昆诺藜,而S-6、S-7则不能.按Cho与Goodmon系统,H-16属G 5株系,S-6及S-7属于G 1株系.H-16及S-6提纯,在蔗糖梯度柱上只形成一条病毒区带.H-16电泳分析RNA及外壳蛋白质均只形成一条带,其分子量分别为2.9×10~6-3.2×10~6及26,000-26,500.分析超速离心只出现一个峰.沉降系数为135-138S.三株系与已知SMV抗血清作用生成沉淀线,彼此间不形成刺状物而完全融合.与WMV-2及WMV-E的抗血清呈阳性反应,而与TRSV、BPMV及WMV-1的抗血清呈阴性反应.粒体线状,长740mm左右.病叶组织中易见风轮状筒形内含物,并可见到病毒粒体.     

黑皮果蔗花叶病病原鉴定

在南宁市郊采集到1份表现褪绿条纹、花叶的黑皮果蔗样品（NN—Ba2）,经差速离心和PEG二次沉淀法提取病毒粗汁液,在电镜下观察到略弯曲的线状病毒粒子;DAC—ELISA检测显示NN—Ba2与甘蔗花叶病毒多克隆抗体和单克隆抗体呈阳性反应;根据SCMV和SrMVcP基因分别设计合成特异引物,利用RT—PCR对NN—Ba2进行分子鉴定,扩增出大小约900bp的预期片段,健康对照未扩增到任何片段;NN—Ba2扩增片段经克隆后测序得到719个有效核苷酸,测序结果在DDBJ上用BLAST进行同源性分析,结果显示该序列与已报道的SCMV广东、云南、广西等地分离物对应的核苷酸序列同源性为97．36％～97．77％,根据马铃薯Y病毒科（Potyviridae）病毒种和株系的划分标准,NN—Ba2鉴定为SCMV。田间采集的另外10份表现花叶症状的果蔗样品经ELISA和RT—PCR检测,证明也感染了SCMV。     

TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段,并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。 发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。