干酪乳杆菌胞外多糖的分离纯化及结构分析

[目的]分离纯化干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）胞外多糖,并对其进行初步分析。[方法]使用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱将干酪乳杆菌LC2W产粗多糖分级纯化,并对所得单一组分进行Sepharose CL-6B和高效液相分析。[结果]分离纯化干酪乳杆菌胞外多糖得到3个组分：G1、G2、G3,分别为粗多糖质量的21.33%、33.53%、29.67%,总回收率为84.53%。G1、G2为中性多糖,Sepha-rose CL-6B和高效液相分析表明,其都是均一组分,平均分子量分别为6.65×105、1.01×104Da。[结论]为今后更深入研究乳酸菌产胞外多糖的结构和生物活性等提供参考。     

重组干酪乳杆菌代谢产物抑菌效果的研究

试验对重组干酪乳杆菌代谢产物的抑菌效果进行研究。利用牛津杯法研究了干酪乳杆菌代谢产物（不同pH值、热和胃蛋白酶处理）对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制效果。结果表明乳杆菌的代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有明显抑制作用,在pH值2.0～4.0时有抑菌活性,并且代谢产物对热稳定,其活性不被蛋白酶破坏。结论：重组干酪乳杆菌能产生对肠道致病菌具有抑制作用的代谢产物。     

干酪乳杆菌CRISPR基因座分析

目的 目前基于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)spCas9为核心的CRISPR/Cas9基因编辑系统在乳酸菌上的应用受到很多限制,亟待开发适合于乳酸菌的基因编辑系统。对6株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的CRISPR系统进行深入分析,并预测激活干酪乳杆菌自身Cas9蛋白所识别的PAM序列,为开发适用于乳酸菌的CRISPR/lcCas9基因编辑系统奠定基础。方法 以已完成全基因组测序的6株干酪乳杆菌为研究对象,利用生物信息学方法对其CRISPR系统进行深入分析,重点对不同菌株的CRISPR系统结构进行解析,并且对Cas蛋白以及spacer的同源性进行分析,最后对CRISPR区重复序列的二级结构以及Cas9蛋白识别的PAM序列进行预测。结果 6株干酪乳杆菌CRISPR系统具有相似的结构,均具有特征性的Cas9蛋白,并且Cas基因序列保守。预测到tracrRNA位于Cas9和Cas1之间,重复序列可以形成茎部长达7个碱基的二级结构。根据CRISPR的间隔区序列,6株干酪乳杆菌可被分为3个基因型,将间隔区逐一进行blast比对,结果表明6个间隔区比对上14个来源不同的原间隔序列,这些间隔序列均来源于不同质粒。干酪乳杆菌lcCas9蛋白识别PAM序列的1、3位碱基偏好T/C、A/C,2、4位碱基对G、A的偏好性比较大。结论 6株干酪乳杆菌CRISPR系统均为type-ⅡA型,Cas序列和重复序列高度保守。DR序列可以形成稳定的二级结构,TGMA为干酪乳杆菌Cas9蛋白高效识别的PAM序列。     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的提纯与性质研究

将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)Zkud202-4液体的发酵液离心去菌体,用硫酸铵盐析得粗酶,透析除盐后进行Sephadex G-75柱层析得到电泳纯碱性蛋白酶,用该法提纯的碱性蛋白酶比活力从粗酶液的155.5 U/mg提高到了954 U/mg,回收率为27.6%.该酶水解酪蛋白的最适反应温度为50℃,最适作用pH为10,且该酶具有较高的热稳定性和耐碱性.经SDS-PAGE测定,其分子质量约为2.5 ku.     

干酪乳杆菌产细菌素的生物学特性分析

[目的]探讨干酪乳杆菌所产细菌素的生物学特征。[方法]对干酪乳杆菌所产的细菌素分别进行抑菌活性、热敏感性、pH范围、蛋白酶敏感性、表面活性剂分析。首先排除过氧化氢、有机酸的干扰,采用牛津杯双层平板法,检测无细胞发酵上清液的抑菌活性。[结果]细菌素对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单核增生李斯特菌具有明显的抑制作用;在pH 3.0~5.5稳定性较好;具有良好的热稳定性;经胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后细菌素失活,表明抑菌成分为蛋白类物质;加入EDTA,抑菌活性明显增强。[结论]干酪乳杆菌所产细菌素是具有良好的热、酸稳定性和较广抗菌谱的蛋白类物质,可为其在防腐保鲜等领域的进一步应用提供科学依据。     

基因prtP编码的细胞膜丝氨酸蛋白酶lactocepin对干酪乳杆菌体内外黏附性的影响

[目的]研究基因prtP编码的细胞膜丝氨酸蛋白酶lactocepin对干酪乳杆菌体内外黏附性的影响。[方法]利用荧光标记技术对干酪乳杆菌亲本株(L.c)及prtP基因缺失突变株(L.cΔprtP)进行标记,对6~8周龄的BALB/c小鼠进行干预,测定亲本株和突变株体内黏附菌体数量的差异,同时测定其在体外对小鼠肠黏液的黏附性。[结果]L.cΔprtP的黏附率总体上较L.c低,黏附能力较L.c弱。说明干酪乳杆菌的黏附性受lactocepin的影响很大。[结论]干酪乳杆菌体内外黏附性与基因prtP编码的细胞膜丝氨酸蛋白酶lactocepin有关。     

干酪乳杆菌NH-2固态发酵基质的选择及优化

[目的]对干酪乳杆菌NH-2固态发酵基质进行筛选及优化。[方法]以麸皮、米糠及豆粕为候选基质,通过基质发酵保湿性、产物活菌数与表面结构的比较,以及后续的复合基质试验,确定干酪乳杆菌NH-2最佳的固态发酵基质。[结果]麸皮与米糠以3：5的比例混合时为干酪乳杆菌NH-2最佳的固态发酵基质,在该条件下产物活菌数最高可达（85.70±2.35）×108cfu/g。[结论]干酪乳杆菌NH-2能以麸皮、米糠为基质通过固态发酵实现其高密度发酵培养。     

高活菌率的干酪乳杆菌微胶囊研究

乳酸菌对环境抗逆性较差,为提高其储存性能,开展了干酪乳杆菌微胶囊化包埋工艺研究。基于透氧率和透湿率测定以及生物相容性试验,对胶囊壁材与辅料进行了筛选评价。采用挤压法分别制备了固芯和多液芯载菌微胶囊,并研究了载菌微胶囊剂在室温下的储存性能和37℃下干燥处理后的残留活菌率。结果表明,微胶囊化处理能够显著提高干酪乳杆菌的储存性能;在植物油储存介质中,载菌微胶囊具有较高的残留活菌率;载菌多液芯微胶囊在37℃下干燥8 h后,残留活菌率为831%,显著高于固芯载菌胶囊。由此,建立了高效“水—油—水”型多液芯干酪乳杆菌微胶囊,在菌活力保持和潜在应用性能方面具有优势。     

干酪乳杆菌表面展示IBDV VP2蛋白

旨在利用pLA载体将IBDV B87株VP2蛋白展示在干酪乳杆菌表面。首先通过RT-PCR扩增VP2基因片段,测序鉴定正确后,将目的片段构建在pLA穿梭质粒上,命名为pLA-VP2,然后将重组质粒电转化到干酪乳杆菌中,构建IBDV重组干酪乳杆菌。应用SDS-PAGE检测重组菌表达目的蛋白VP2,得到约90 kDa的融合蛋白,与预期结果相符。Western blot结果显示VP2蛋白可以与抗IBDV多抗血清发生特异性反应,具有很好反应原性。流式细胞仪的散射光检测器可以捕捉到pLA-VP2重组菌菌体表面的荧光,且重组菌荧光强度强于pLA菌对照组,应用正态分布函数计算pgsA-VP2融合蛋白的表达效率,约为80%。结果表明IBDV VP2蛋白成功展示在干酪乳杆菌表面。     

益生菌Lactobacillus casei Zhang冻干粉对小鼠急性毒性的研究

通过研究益生菌Lactobacillus casei Zhang冻干粉对小鼠急性毒性作用,为该菌株的安全应用提供依据。连续14 d对小鼠灌胃不同剂量的L.casei Zhang冻干粉,各剂量组小鼠的一般体征、肝脏功能、脏器指数以及肝、肾、脾形态学的观察结果与对照组相比无显著差异（P>0.05）。急性毒性试验及相关指标检测结果显示L.casei Zhang冻干粉无毒副作用。     

益生菌Lactobacillus casei|Zhang 高密度发酵中试工艺及动力学研究

在益生菌L.caseiZhang高密度培养小试（3L）基础上,进行30L到150L逐级放大中试生产工艺的研究以确定规模化生产工艺。在优化的发酵工艺下,150L规模发酵菌体密度可达2.9×10^10cfu/mL,与小试水平无差异。采用origin7.5软件在logistic equation基础上建立L.caseiZhang的生长和葡萄糖代谢动力学模型,模型与试验值拟合良好,平均误差小于10%,能够较好地反应发酵过程。初步探讨发酵后菌体的离心和冷冻干燥过程对菌体的影响,虽然发酵液经离心收集菌体后冷冻干燥可得到平均活菌数2.65×10^11cfu/g的菌粉,能够满足益生菌制剂和发酵剂对高活菌数的要求,但冻干前后活菌得率仅49.97%。有必要针对L.casei Zhang的冻干保护剂和冻干工艺进一步优化,以提高菌体存活率得到更高菌体浓度的益生菌粉。     

暗纹东方鲀胃蛋白酶的分离纯化及部分性质研究

为了探明 pH 值、温度及矿物质离子对暗纹东方鲀胃蛋白酶活性的影响效果,用暗纹东方鲀的胃为材料,经柠檬酸缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀,CM-纤维素离子交换柱、Sephedex G75 层析柱纯化,获得比活为 7.13μmol/(min·mg)的胃蛋白酶.酶经聚丙烯酰胺电泳,表现为单一蛋白带,经 SDS-PAGE 测得酶的亚基相对分子质量为18 600.酶水解酪蛋白的最适温度为50 ℃,在pH2.5, ℃下酶催化酪蛋白水解的Km值为0.715 mmol/L;pH5.0, 3737 ℃下酶催化 N-卞氧羰酰 L-赖氨酸对-硝基酚酯(CBZ-Lys.pNP)的 Km 值为 0.112 mmol/L.几种矿物质离子对酶活力的影响表明,Ca2+,Mn2+,Mg2+对酶有激活作用,Zn2+,Fe2+对酶有抑制作用.     

南美白对虾丝氨酸蛋白酶的分离纯化及性质研究

通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose、Phenyl-Sepharose、Hydroxyapatite、Superdex75等方法,从南美白对虾消化腺中分离得到一种丝氨酸蛋白酶.SDS-PAGE结果显示,其分子质量约为28ku,最适pH值与最适温度分别为9.0和40℃,且pH值在7.0～10.0之间以及温度在40℃以下有较高的稳定性.底物特异性实验与抑制剂实验结果表明,该酶属于类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶.动力学实验显示,以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物时,Km=0.69μmol/L,Kcat=0.33S-1,Kcat/Km=4.78×105（mol/L）-1S-1.     

干酪乳杆菌KLDS1.0381高密度培养条件研究

以麦芽汁培养基为基础培养基,研究干酪乳杆菌生长的碳源、氮源、营养因子及培养条件,通过单因子试验和正交试验确定干酪乳杆菌的最优培养基配方和最佳培养条件,进一步选择菌种的最佳浓缩、富集条件。结果表明,培养基最优配方为麦芽汁培养基中添加1%乳糖、2%胰蛋白胨、20%西红柿汁和0.2%牛肉膏,初始pH 7.0;最适摇瓶装液量为100%。在最适条件下,37℃培养12 h后菌液中活菌数可达到1.37×1010cfu.mL-1。优化浓缩离心富集条件,4℃条件下,4 000 r.min-1离心30 min,离心后菌种存活率为76.27%,浓缩倍数为62.87,干酪乳杆菌高密度培养物中活菌密度可达8.62×1011cfu.g-1。