联合环介导等温扩增和横向流动试纸条可视化检测副猪嗜血杆菌

为快速鉴定临床上的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)感染,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术结合横向流动试纸条(LFD)测定法进行核酸扩增和结果的可视化判定。选择副猪嗜血杆菌inf B基因中保守序列设计5组环介导等温扩增引物,筛选最适引物组;用生物素和6-FAM标记内引物用于LAMP扩增反应,结合LFD建立了副猪嗜血杆菌LAMP-LFD快速检测方法,并测试该方法的特异性、灵敏度、重复性和临床应用效果。结果表明：1)优化后的LAMP在66℃下运行30 min, LFD可以在5 min内特异性、直观地检测到副猪嗜血杆菌;2)特异性强,与其他5种细菌无交叉反应;3)敏感度高,其最低检测浓度为1.285×10^-12 ng/μL,较普通PCR方法灵敏度显著提高;4)采用该方法对52份临床样品进行检测,副猪嗜血杆菌阳性率为19.2%(10/52),与LAMP检测结果的符合率为100%。综上,本研究建立的LAMP-LFD方法可特异、灵敏、准确地应用于副猪嗜血杆菌的可视化检测,而且操作简单、仪器设备要求及检测成本低、耗时短,适用于基层养殖场副猪...     

副猪嗜血杆菌分离鉴定与PCR检测方法的建立及应用

从养猪场送检的猪肺病料中分离到3株疑似副猪嗜血杆菌(HPS)可疑菌株。经形态镜检、染色特性、生化和部分生物学特性试验,初步鉴定为HPS。在细菌学鉴定基础上,设计合成3对引物,分别以3株分离菌株的DNA为模板进行PCR扩增,结果均扩增出822 bp8、24 bp和1.9 kb的预期特异性条带。以HPS GD株作为参考阳性菌株,以P1、P2为引物,设计优化PCR反应程序,建立HPS PCR检测方法,并应用于临床病料检测。结果表明,所建立的HPS PCR检测方法特异与敏感性高、适用性强,可应用于HPS感染的诊断和检测。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

采用超声裂解副猪嗜血杆菌分离株5型菌体上清作为包被抗原,初步建立副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法。通过棋盘滴定法筛选确定最佳反应条件:抗原包被浓度50mg/L,37℃作用2h后4℃过夜包被,血清的稀释度为1∶320,抗原抗体反应时间为50min,酶标二抗稀释度为1∶12 000,作用时间为30min,底物显色时间为15min。经特异性、敏感性和符合性试验检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查。     

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

针对副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)16 S rRNA序列设计1对特异性引物,能扩增出821 bp的特异性DNA片段,并据此建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌PCR方法,临床试验证明该方法具有很好的特异性和敏感性.13份疑似病料检测结果表明,PCR检测结果与传统生化鉴定结果符合率为100％.结果表明已成功建立了副猪嗜血杆菌PCR检测方法,并可应用于临床副猪嗜血杆菌的检测.     

副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法的建立与应用

【目的】建立快速检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法,以便能够对副猪嗜血杆菌病进行快速、准确的诊断。【方法】利用9株(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2)副猪嗜血杆菌陕西分离株制备平板凝集抗原,用其免疫健康家兔制备血清抗体,建立副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法,对制备抗原的优势菌株进行筛选,并对该方法的特异性、敏感性、抗原最佳工作浓度进行检测。【结果】选出Ew株作为制备抗原的种子菌株,成功建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法;该方法具有良好的特异性和敏感性,抗原最适工作浓度为8×109 CFU/mL。采用本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法对临床血清样品的检测结果与临床诊断结果基本一致。【结论】建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法能够对副猪嗜血杆菌病做出较为快速、准确的诊断;陕西省存在副猪嗜血杆菌不同程度的感染,规模猪场集中饲养的猪感染副猪嗜血杆菌的比率明显高于散户。     

TaqMan探针荧光PCR检测副猪嗜血杆菌方法的建立和应用

为了建立基于TaqMan探针荧光PCR技术检测副猪嗜血杆菌的方法,本试验参考GenBank已发表的副猪嗜血杆菌(Hemophilus parasuis,HPS)转录起始因子infB基因序列,利用生物学软件Primer Express 2.0设计特异性引物和探针;并对副猪嗜血杆菌标准菌株提取DNA后进行PCR扩增,将产物测序鉴定后克隆到pMD1s-T载体,再转化到大肠杆菌感受态细胞,细菌培养后对菌液进行PCR扩增,把产物测序鉴定后获得的重组质粒作为标准阳性对照;最后将建立的TaqMan探针荧光PCR方法进行灵敏度、特异性、稳定性试验.结果显示,该检测方法可以达到1μl1.0×101拷贝数量级的灵敏度;另外,该方法可以将HPS和大肠杆菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌分开,特异性良好;稳定性试验显示,2次批内变异系数分别为0.65％和0.92％,批间变异系数为1.31％,稳定性良好.对口岸送检的56份猪肉和12份血浆蛋白粉样品进行检测,结果表明TaqMan探针荧光PCR方法和细菌分离方法的检测效果一致.     

副猪嗜血杆菌病的防治

副猪嗜血杆菌病,也作猪副嗜血杆菌病。副猪嗜血杆菌病曾一度被认为是由应激所引起的。     

副猪嗜血杆菌病的防治方法

猪的上呼吸道上经常寄生着一种病菌就是副猪嗜血杆菌,这种病菌是一种条件性致病菌,各种应激因素都容易引发此种病菌,它在自然环境中大量存在.基于此,文章主要对副猪嗜血杆菌病的防治方法进行了探讨.     

副猪嗜血杆菌病的诊治

副猪嗜血杆菌病是一种由副猪嗜血杆菌引起猪的接触性传染病,又称纤维性浆膜炎和关节炎.副猪嗜血杆菌病的发病率每年呈明显的上升趋势,对猪场造成严重的经济损失.本文介绍了一例保育猪副猪嗜血杆菌病的发病情况、临床剖检、实验室诊断、治疗与防控,以期为副猪嗜血杆菌病的临床诊断与防治提供参考.     

红尾皇冠鱼无乳链球菌病LAMP检测方法的建立与应用

以cfb基因保守序列的6个区域设计4条特异性引物,利用链置换DNA聚合酶( BstDNA polymer：ase)在恒温(65℃)下保温40 min,建立了无乳链球菌 Streptococcus agalactiae 的 LAMP 技术。建立的LAMP方法能够特异性地检测无乳链球菌,检测灵敏度为3·7×101~3·7×102 cfu/mL,反应前加入显色剂钙黄绿素避免二次污染。现场应用中采用FTA卡采集红尾皇冠鱼Aequidens rivulatus病鱼肝脏组织病原菌,操作简便、快捷。研究表明,针对无乳链球菌cfb基因建立的LAMP检测方法具有较高的特异性及稳定性,尤其是具有快速、简便、成本低等优点,可用于无乳链球菌的野外现场快速检测。     

转基因玉米NK603品系成分LAMP快速PCR检测方法的建立

根据转基因玉米品系NK603外源插入片段与玉米基因组序列设计品系特异性引物,建立转基因玉米品系NK603的品系特异性环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行灵敏度、特异性测试。试验表明该方法能够快速检测出转基因玉米NK603品系成分,检测灵敏度为0.1%,并具有较高的特异性和较好的稳定性。     

环介导等温扩增法（LAMP）检测最短尾短体线虫

为了快速、简便、准确地检测重要植物病原线虫—最短尾短体线虫（ Pratylenchus brachyurus ）,依据GenBank中短体线虫的线粒体DNA细胞色素氧化酶I（mtDNA COI）序列,设计了扩增最短尾短体线虫的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）引物,并对LAMP反应条件进行优化,成功建立了一种可特异、快速检测最短尾短体线虫的LAMP体系。该体系在64℃下反应60 min,扩增效率最高。用琼脂糖凝胶电泳、酶切分析和SYBR Green I染色均能特异检测到最短尾短体线虫的扩增产物。所建立的LAMP体系能从供试的9种短体线虫和另外10种植物线虫中特异检测出最短尾短体线虫,其灵敏度可检测到1/200条线虫DNA,是常规PCR的10倍。表明本研究建立的最短尾短体线虫的LAMP检测体系,可用于最短尾短体线虫的快速检测。     

青稞条纹病LAMP检测体系的建立

【目的】建立青稞条纹病的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术检测体系,为青稞种子带菌检测及其条纹病的有效防控提供参考。【方法】根据麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）的ITS-rDNA序列区间设计5组引物,从中筛选特异性引物,并通过设置60,61,62,63,64和65 ℃ 6个温度梯度来优化LAMP反应体系的温度,以建立高效检测麦类核腔菌的LAMP技术体系;分别以麦类核腔菌、大麦坚黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、细链格孢和禾谷镰孢菌基因组DNA为模板进行LAMP扩增反应,对该体系的特异性进行检测;以310,31,3.1,0.31,0.031和0.003 1 pg/μL的麦类核腔菌基因组DNA为模板,对该体系的灵敏度进行分析;最后利用该体系对肚里黄、柴青1号、1141、北青9号和昆仑15 等5个青稞主栽品种的种子带菌率进行检测。【结果】青稞条纹病LAMP检测体系的特异性引物为引物组2,最佳反应温度63 ℃,反应时间70 min;该检测体系对麦类核腔菌具有良好的特异性,其最低检测限为0.31 pg/μL;肚里黄、柴青1号、1141、北青9号和昆仑15种子的带菌率分别为68.18%,72.73%,100%,77.27%和68.18%。【结论】建立了青稞条纹病LAMP检测体系,该体系能在63 ℃、70 min内检测出青稞种子是否携带条纹病菌。     

检测禽多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增(LAMP)方法的建立

以禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)C48-1为研究对象,利用LAMP方法对Pm进行快速检测.结果表明:LAMP方法在恒温65℃下,1 h内就可以检测到Pm;LAMP方法最低可检测100 pg.μL-1Pm基因组DNA.该方法不需要精密的温度循环装置,有恒温加热设备就可以满足检测条件,适合基层临床应用.     

副猪嗜血杆菌对猪气管上皮细胞的黏附作用及其黏附模型的建立

为了探讨副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)与原代培养的猪气管黏膜上皮细胞的相互作用,应用气管支气管结扎灌注酶冷消化法分离气管黏膜上皮细胞,于胶原覆盖的盖玻片上培养,使上皮细胞分化成假复层黏膜纤毛上皮细胞,然后以对数生长期不同Hps含量的菌液感染上皮细胞和猪脐静脉血管内皮细胞,分别作用1、2、34、h后,通过革兰氏染色法观察Hps对细胞的黏附情况。结果表明,Hps可黏附在上皮细胞和内皮细胞表面;Hps对气管上皮细胞有毒性作用,致细胞变性坏死和凋亡;Hps对细胞的黏附力与其在菌液中含量和作用时间有关,以菌落形成单位计,当含量为1.0×108mL-1且感染4 h后,黏附效果最好。高倍显微镜下可见大量Hps黏附于猪气管上皮细胞,只有个别Hps黏附于猪血管内皮细胞表面。说明Hps对猪气管黏膜上皮细胞的黏附能力远强于猪血管内皮细胞,可以利用猪气管黏膜上皮细胞建立副猪嗜血杆菌的黏附细胞模型。     

利用环媒恒温基因扩增法检测生猪刚地弓形虫

基于已公布的刚地弓形虫Sag2基因序列设计了1套特异引物,经过条件优化,成功建立了针对刚地弓形虫(简称弓形虫)的环媒恒温基因扩增检测法.根据扩增弓形虫和其他几种病原生物的效果对该方法进行评估.结果表明,该方法只检出致病性弓形虫,特异性良好;检测最低速殖子浓度为4个/μL.对长沙、株洲、湘潭三地生猪血样检测的结果是仔猪、成猪和种母猪弓形虫感染率分别为6.45%、7.69%和15.38%.     

陕西省副猪嗜血杆菌的分离及其基于tbpA基因的分型鉴定

【目的】检测副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)在陕西关中地区的感染状况,并对分离菌株进行基因型分析,为该地区副猪嗜血杆菌病的流行病学研究提供依据。【方法】从陕西关中地区14个发生多发性关节炎和浆膜炎的猪场采集30份病料,分离细菌,通过其培养特性和形态观察及生化试验和PCR等方法对分离株进行鉴定,并用Blast软件对分离株的16SrRNA序列进行同源性比对,同时对分离菌株进行了几种常见药物的敏感性检测。通过3种限制性内切酶TaqⅠ、AvaⅠ、AfaⅠ,对已被鉴定为副猪嗜血杆菌菌株的转铁结合蛋白A编码基因(tb-pA)进行PCR-RFLP基因分型。【结果】分离得到了5株疑似副猪嗜血杆菌菌株,经培养特性和形态观察、生化试验、PCR鉴定及序列同源性比对,将其鉴定为副猪嗜血杆菌。PCR-RFLP分型结果表明,从5株副猪嗜血杆菌分离株中共得到了4种基因型,分别为EBC、BBJ、EBJ、EAD。药物敏感性检测结果表明,分离菌株的耐药性均较强,且不同分离株对同一药物敏感性不同。【结论】副猪嗜血杆菌病在陕西关中地区猪群中流行比较严重,其基因型较多且与其他地域的菌株有一定差异。