粳型超级稻胚性细胞悬浮系的建立及植株再生

以北方粳型超级稻沈农265成熟胚为材料,对其胚性悬浮细胞系建立与植株再生进行了研究.结果表明,弱光下培养20 d,有利于成熟胚诱导出质量较好的愈伤组织,这些愈伤组织在添加2,4-D(3.0 mg/L)和脯氨酸(500 mg/L)的N<,6>固体培养基上进行状态调整后,可获得适于悬浮培养的胚性愈伤组织.悬浮培养时适宜的2,4-D浓度为2～3 mg/L;起始接种量以20 mg/mL的效果较好;最佳继代时间是7 d.悬浮细胞团先经固体继代培养获得愈伤组织小块,再将愈伤小块干燥处理2 h后进行分化,可显著提高植株再生率,愈伤组织绿点分化率和成苗率分别达58.6%和27.2%.     

橡胶树热研8—79原生质体培养再生植株

【目的】优化橡胶树热研8-79原生质体分离和培养条件,建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系,为橡胶树体细胞杂交育种奠定基础。【方法】以橡胶树热研8-79花药愈伤组织建立的胚性细胞悬浮系为试验材料,设计不同酶组合、酶解时间和悬浮细胞继代时间进行原生质体分离,采用不同培养基、看护细胞浓度和接种密度进行原生质体培养,对原生质体分裂发育的小愈伤组织进行体细胞胚诱导及植株再生培养,统计原生质体的产量、分裂频率、体胚数及体胚萌发率。【结果】酶组合为纤维素酶1.50%＋果胶酶0.15%＋离析酶0.50%、酶解时间为12 h时,继代培养第5 d的胚性悬浮细胞达最高产量（3.6 ×107个/mL PCV）;用酶解细胞和看护细胞继代培养基分别作为原生质体液体培养基和看护培养基,比使用KPR培养基更有利于原生质体的分裂,当看护细胞浓度为5%、接种密度为5 ×105个/mL时原生质体的分裂频率最高,达54%。原生质体持续分裂形成肉眼可见的小愈伤组织增殖后经体胚发生途径发育成完整的小植株。【结论】通过优化橡胶树热研8-79胚性悬浮细胞原生质体分离的酶组合、酶解时间、继代培养时间及看护培养过程中培养基组成、看护细胞浓度和接种密度等影响因素,可以建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系。     

橡胶树热研8-79原生质体培养再生植株

[目的]优化橡胶树热研8-79原生质体分离和培养条件,建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系,为橡胶树体细胞杂交育种奠定基础.[方法]以橡胶树热研8-79花药愈伤组织建立的胚性细胞悬浮系为试验材料,设计不同酶组合、酶解时间和悬浮细胞继代时间进行原生质体分离,采用不同培养基、看护细胞浓度和接种密度进行原生质体培养,对原生质体分裂发育的小愈伤组织进行体细胞胚诱导及植株再生培养,统计原生质体的产量、分裂频率、体胚数及体胚萌发率.[结果]酶组合为纤维素酶1.50%+果胶酶0.15%+离析酶0.50%、酶解时间为12h时,继代培养第5d的胚性悬浮细胞达最高产量(3.6 ×107个/mL PCV);用酶解细胞和看护细胞继代培养基分别作为原生质体液体培养基和看护培养基,比使用KPR培养基更有利于原生质体的分裂,当看护细胞浓度为5%、接种密度为5×105个/mL时原生质体的分裂频率最高,达54%.原生质体持续分裂形成肉眼可见的小愈伤组织增殖后经体胚发生途径发育成完整的小植株.[结论]通过优化橡胶树热研8-79胚性悬浮细胞原生质体分离的酶组合、酶解时间、继代培养时间及看护培养过程中培养基组成、看护细胞浓度和接种密度等影响因素,可以建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系.     

油棕细胞悬浮培养及植株再生技术

【目的】建立油棕胚性体细胞悬浮培养植株再生技术体系,为油棕优株无性系种植材料高效繁育、 细胞生物学研究、生物技术育种研究等提供技术平台和参考。【方法】以源于成龄油棕芯叶的瘤状愈伤组织为 材料,采用不同质量浓度 2,4-D、麦草畏与德夸霉素组合诱导易碎胚性愈伤组织,分析不同激素质量浓度及其 组合对油棕体细胞悬浮系增殖与后续体胚发育的影响。【结果】0.1 mg/L 德夸霉素与一定浓度 2,4-D 或麦草畏 组合,促进胚性愈伤组织形成,0.1 mg/L 德夸霉素与 1 mg/L 麦草畏组合诱导易碎胚性愈伤组织较佳,诱导率为 28.67%;用生长旺盛、质地松散的易碎胚性愈伤组织悬浮培养 21 d 可建立生长状态较均一、分散性好的悬浮 细胞系;0.3 mg/L 德夸霉素与 1 mg/L 麦草畏组合较有利于悬浮细胞系增殖和后续体胚发育;将悬浮细胞系转到 MS+ 谷氨酰胺 100 mg/L + 蔗糖 30g/L 培养基上,于 28（±2）℃、2 000 lx 下进行胚诱导培养,每两周更换新培 养基 1 次,培养 60 d 可获得直径大于 1 mm 的胚,最高每瓶 295 粒;将大于 1 mm 的胚转到固体培养基培养可 获得再生植株。【结论】适当质量浓度德夸霉素与 2,4-D 或麦草畏组合,促进油棕芯叶瘤状愈伤组织形成易碎 胚性愈伤组织;用生长旺盛、质地松散的易碎胚性愈伤组织悬浮培养 21 d 可建立生长状态较均一、分散性好的 悬浮细胞系;初步发现含适当质量浓度德夸霉素与麦草畏液体培养基利于悬浮细胞系增殖和后续体胚发育。     

徐薯55-2的胚性细胞悬浮培养

为优化胚性愈伤的培养条件,建立甘薯高效胚性悬浮培养试验操作体系,以徐薯55-2、徐薯18、徐薯22、徐薯28、徐薯29和徐紫薯5号等6个甘薯品种(系)茎尖诱导的胚性愈伤组织为材料,通过比较不同品种的胚性愈伤组织诱导率、愈伤状态等的差异,筛选出愈伤诱导率高,愈伤状态好,体胚诱导率及成苗率高的品种徐薯55-2。通过测定细胞沉降体积(SCV)研究徐薯55-2胚性细胞悬浮系的接种密度、接种量、摇床转速对胚性悬浮细胞生长的影响。结果表明,徐薯55-2胚性细胞悬浮系适宜培养条件为接种密度1∶25,接种量1.4mL,摇床转速100r/min。     

继代培养时间对抗性黑松体胚发生的影响

以继代培养0.5、1.5 a和3.5 a的抗性黑松37#家系胚性愈伤组织为材料,观察不同培养时间胚性细胞的形态和体胚成熟的过程,并对愈伤组织的增殖率、每克愈伤形成的体胚数量及体胚萌发率和植株成活率进行测定。结果表明:在继代培养过程中,胚性胚柄细胞团(ESM)结构逐渐疏松,胚柄细胞呈现缩短、增粗的现象;培养时间对抗性黑松愈伤组织的增殖、分化、体胚萌发及植株成活率均有显著影响。3种不同培养时间愈伤组织的增殖率分别为200.37%、182.47%和111.63%,每克胚性愈伤组织形成成熟体细胞胚分别为77、31、5个,萌发率分别为84.43%、51.10%、11.13%;植株成活率分别为73.00%、50.00%、6.70%,均呈下降趋势;3种愈伤体胚成熟的时间也存在显著差异,继代培养时间越长,体胚分化成熟过程越慢,愈伤组织形成子叶胚的时间最短为46 d,最长为74 d。因此,抗性黑松胚性愈伤组织在继代培养过程中胚性逐步降低,体胚发生和植株再生能力下降,短期培养的胚性愈伤组织(0.5 a)为抗性黑松体胚发生较为理想的初始材料,且愈伤组织继代培养时间不宜超过1.5 a。     

24个水稻抗稻瘟病单基因鉴别品系悬浮细胞系的建立

以IRRI-Japan24个水稻抗稻瘟病单基因鉴别品系和对照普感品种丽江新团黑谷（LTH）的成熟种胚为材料诱导愈伤组织,诱导过程中发现不同基因型愈伤组织诱导能力差异极大,愈伤组织诱导率在14．3％-97．1％,将2,4-D浓度从3．0mg／L提高到5．0mg／L时,可提高愈伤组织诱导率。经诱导成功的水稻愈伤组织继代培养一段时间后,不同基因型的愈伤组织继代特性出现明显差异,选取生长状态良好的单株系愈伤组织建立了水稻悬浮细胞系。悬浮培养过程中对胚性悬浮系的细胞形态变化进行了观察。发现细胞的形状由开始的不规则、长条形逐渐转交成近椭圆形、椭圆形;细胞质由很淡、透明、具明显的大液泡逐渐转变成浓厚、不透明、较小的液泡。大多数品系的单细胞率由30％-40％提高到60％～90％。本研究通过努力,建立了14种单基因型水稻材料的稳定悬浮细胞系,构建过程中发现基因型、继代培养特性、愈伤组织类型选择是影响胚性悬浮细胞系建立的重要因素。该悬浮细胞系的建立为进一步研究稻瘟菌分泌蛋白与水稻细胞互作的生化机理奠定基础。     

籼稻YTB成熟胚愈伤组织继代培养条件试验

为确定籼稻YTB成熟胚愈伤组织继代培养的最佳条件,对籼稻愈伤组织进行不同继代培养条件优化组合试验,研究不同因素对籼稻愈伤组织继代培养的影响。结果表明:NB培养基是较适合籼稻愈伤组织继代生长的培养基;籼稻YTB成熟胚愈伤组织不适合二次继代;铁盐浓度对籼稻愈伤组织的继代培养有明显影响;水解酪蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺及硫代硫酸钠等能改善籼稻愈伤组织的质量,降低褐化率;抗坏血酸(VC)对籼稻胚愈伤组织的继代生长及抗褐化无明显影响;形态学观察和细胞学观察的一致性证明了外源腐胺PUT(30 mg/L)在籼稻愈伤组织继代培养中可以使愈伤组织保持良好的胚性,从而提高后续遗传转化的转化率。     

栓皮栎体胚再生与增殖能力的保持研究

【目的】提高栓皮栎体胚的再生与增殖能力。【方法】将栓皮栎不同发育阶段合子胚诱导的胚性愈伤组织及不同发育时期的体胚,分别接种于含不同组合激素的MS培养基上,在不同光照条件下培养,探讨影响栓皮栎体胚再生与增殖能力保持的因素。【结果】随着继代次数的增加,胚性愈伤组织再生体胚能力呈下降趋势;6-BA与NAA配合使用可延缓继代过程中胚性愈伤组织再生体胚能力的下降,1.00mg/L 6-BA与0.25mg/L NAA是继代中保持胚性愈伤组织再生体胚能力的最佳培养基激素组合;胚性愈伤组织再生体胚需要自然散射光,强光及全程暗培养均不利于体胚再生;合子胚外植体发育程度影响胚性愈伤组织再生体胚能力,处于心形期及早子叶形期的幼嫩合子胚诱导的胚性愈伤组织,其再生体胚能力强于成熟子叶形合子胚诱导的胚性愈伤组织;体胚发育阶段越老,再生与增殖体胚能力越差,胚性愈伤组织及处于球形期的体胚,再生增殖体胚能力强于其他发育时期的体胚。【结论】选择处于心形期的幼嫩合子胚诱导胚性愈伤组织,然后在含1.00mg/L 6-BA与0.25mg/L NAA的MS培养基上于自然散射光下培养,可有效保持栓皮栎的体胚再生与增殖能力。     

香蕉胚性愈伤组织的诱导及胚性细胞悬浮系的建立

分别以3个香蕉品种的多芽体茎尖和5个香蕉品种的未成熟雄花为外植体,诱导产生胚性愈伤组织．结果分别从2个基因组类型为AAA的品种的多芽体茎尖和未成熟雄花获得了胚性愈伤组织,而未能从基因组类型为AAB或ABB的香蕉品种中获得胚性愈伤组织．胚性愈伤组织的诱导率受基因组类型、品种和培养条件等因素的影响．以上述4个品种的胚性愈伤组织为起始材料成功建立了胚性细胞悬浮系,不同香蕉品种,从其胚性愈伤组织建立胚性细胞悬浮系的难易程度有所不同．     

宽皮橘蕉柑的胚性愈伤组织诱导、悬浮细胞系建立及植株再生

取蕉柑花后 5周幼果的幼胚接种于含不同浓度BA、KT与IAA组合的MT培养基上 ,结果表明 ,暗培养条件是蕉柑胚性愈伤组织诱导成功的关键 .胚状体在后期发育中畸形胚的比例很高 ,经切割后 ,在MT +BA2 .0mg·L-1+IAA0 5mg·L-1+蔗糖 0 0 3kg·L-1培养基上可诱导产生丛芽 ,诱导率为 2 6 7% .幼芽在 1/ 2MT +NAA 1 0mg·L-1培养基上生根率达到了 87 0 % .蕉柑胚性愈伤组织在MT液体培养基中不断地继代培养 ,可形成生长稳定的胚性悬浮细胞系 ,体胚诱导实验证明悬浮细胞系具有很强的体细胞胚胎发生能力 .     

水稻原生质体制备条件的优化及其细胞壁变化的快速检测

以疣粒野生稻和栽培稻02428的成熟种子为材料,对愈伤组织的诱导和继代、胚性悬浮细胞系建立、原生质体制备、再生细胞团分化及植株再生进行研究。结果表明:(1)水稻愈伤组织诱导的最佳2,4-D浓度为0.014mmol/L;(2)胚性悬浮细胞系建立的最佳条件为AA悬浮培养基+0.009mmol/L 2,4-D,每25mL液体培养基加入0.4g愈伤组织的初始接种量,7d的继代周期;(3)原生质体制备的最佳条件为20g/L纤维素酶+1g/L果胶酶,酶解5h,800r/min离心5min;(4)用荧光增白剂(VBL)细胞壁染色液可以快速、准确的检测原生质体制备及培养过程中细胞壁的变化情况。     

湿地松及其杂种的体细胞胚胎发生与植株再生

【目的】明确适合湿地松Pinus elliottii及其杂交种的体细胞胚胎发生条件,建立体胚成熟萌发的技术。【方法】以2016年6月采集的2个湿地松家系(EE1,EE2)、2个湿地松杂交种家系(EC,EH)的未成熟合子胚(含胚乳)为材料,从诱导、增殖、成熟到萌发配制3个系列培养基,比较外植体采集时间、家系、基本培养基对胚性愈伤组织诱导的影响。用显微镜进行胚性愈伤组织鉴别后,进一步挑选诱导形成的胚性愈伤组织进行增殖、成熟、萌发,最终获得再生植株。【结果】湿地松及其杂交种合子胚的发育进程可划分为8个阶段,阶段Ⅱ、Ⅲ为未成熟胚,适合体胚发生,EC最早出现阶段Ⅲ合子胚。外植体诱导产生具有胚性胚柄团(ESM)结构的胚性愈伤组织,可进一步增殖。诱导培养基对愈伤组织形成及胚性愈伤组织占比具有较大影响,3种诱导培养基(T1、T2和T3)产生愈伤组织效率最高的为T1培养基(49.0%),胚性愈伤组织所占愈伤组织的比例最高为T2培养基(22.4%)。培养基配方的诱导率存在基因型间的差异,T1培养基整体诱导率低;T2培养基对家系EE1诱导率最高,为5.82%;T3培养基对参试材料均能诱导成功,且平均诱导率最高,为3.75%。随采样时间延后,家系EE1、EH的体胚诱导率逐渐增加,家系EE2、EC的体胚诱导率则随采样时间延后逐渐降低。体胚诱导率与合子发育阶段结果基本一致,阶段Ⅲ合子胚均出现较晚,前期诱导率低。胚性愈伤组织继代24次以后,胚活性逐渐降低。成熟培养基T1S和T3S可完成胚的成熟,平均每克成熟培养基分别成熟23.3和15.9个子叶胚,萌发率为32.1%,移栽保存率为47.8%。【结论】诱导培养基T3对参试家系均能诱导成功,T3具有较广泛适用性,各家系在阶段Ⅲ合子胚出现时表现出较大的诱导率,阶段Ⅲ合子胚可能为体细胞胚发生的最佳诱导阶段。建立了湿地松及其杂种体细胞胚发生方法并形成了再生植株。     

气动生物反应器油松胚性愈伤增殖体系的建立研究

目的大量具有活性的胚性愈伤组织的增殖可为油松体细胞胚胎发生研究和植株再生提供充足的材料,锥形瓶悬浮培养体系下胚性愈伤组织的增殖率低且易酸化坏死,建立气动生物反应器油松胚性愈伤增殖体系可促进油松胚性愈伤组织的增殖。方法本研究以油松愈伤组织为材料,利用L₉（34）正交试验设计,探究了生物反应器中愈伤接种量、新旧培养基的配比和激素浓度3个因素对愈伤组织增殖的影响,建立了增殖体系。而后在相同条件下与锥形瓶悬浮培养进行对比。结果结果表明:气动生物反应器中每100 mL液体培养基内接种胚性愈伤10 g,2,4-D 0.2 mg/L,保留20%的旧培养基时能使胚性愈伤增殖率达到最高,可达216.18%;结论与锥形瓶悬浮培养体系相比,ALB系统在一周内胚性愈伤生长速度更快,为锥形瓶悬浮培养体系的3.15倍;显微观察显示增殖的胚性愈伤组织稳定且优质。该研究为基于油松体胚体系的大规模扩繁提供技术支持。      

丰花月季愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养

分别以丰花月季叶片、叶柄和茎段为外植体诱导出愈伤组织,并建立细胞悬浮系。结果表明,丰花月季叶片和茎段是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体;诱导松散型愈伤组织的最佳激素浓度配比是NAA 4 mg·L-1+2,4-D 1 mg.L-1+BA 1 mg.L-1;细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为1.5×104～3.0×104个.mL-1时;继代培养4～5代时,可得到稳定的悬浮细胞系。     

咖啡胚性愈伤组织诱导研究

以咖啡叶片为外植体材料,开展了灭菌条件筛选、初级愈伤诱导及胚性愈伤诱导的研究。结果表明,1.5%次氯酸钠溶液灭菌30min结合采样前一周用农业杀菌剂处理采样植株为适宜的咖啡叶片外植体的灭菌条件;在细胞分裂素与生长素同时存在的条件下,不同配比激素处理均能诱导出初级愈伤组织,其中,1mg/L2,4-D+2mg/L6-BA处理诱导的初级愈伤组织紧实,水渍化比例较小,是较为适宜的初级愈伤诱导激素组合;相比KT,6-BA具有更好的胚性愈伤诱导效果,细胞分裂素与生长素比例在4∶1左右时,胚性愈伤诱导效率较高。本研究筛选出了咖啡胚性愈伤诱导的适宜条件,并对影响胚性愈伤诱导效率的相关因素进行了探讨,旨在为提高咖啡组培苗繁育效率及促进咖啡优良品种规模化推广应用提供技术支撑。     

杜仲愈伤组织继代培养条件的优化

为了建立杜仲愈伤组织再生体系,为转基因研究提供平台,以成熟胚诱导的浅黄色愈伤组织和幼胚诱导的乳白色愈伤组织为材料,研究不同培养基、继代时间、继代次数对杜仲愈伤组织生长和不定芽诱导的影响。结果表明:浅黄色愈伤组织继代培养后具有不定芽的分化能力,乳白色愈伤组织继代培养后褐化死亡;愈伤组织继代培养基为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L,继代周期为18d;愈伤组织继代次数对愈伤组织增殖有显著影响,以继代4次的增殖倍数最高,达2.5;愈伤组织继代次数对不定芽的诱导有显著影响,以继代2次的愈伤组织不定芽诱导率最高,达到66.7%,继代4次的愈伤组织不定芽的增殖系数最高,为3.2。     

甜玉米和糯玉米幼胚离体培养试验

以N1、N28、T5、1＇6等4个玉米（Zea mays L．）自交系为材料,进行幼胚离体培养．通过愈伤组织的诱导、继代、分化和植株再生等试验,对影响玉米幼胚愈伤组织诱导率和胚性率的因素进行了分析．结果表明,甜、糯玉米幼胚诱导出愈伤组织的能力较为普遍,但诱导率及胚性率因基因型不同、所选用培养基不同而不同,基因型是影响玉米幼胚愈伤组织诱导和幼苗再生的一个重要因素;选择大小为1～2mm的幼胚作为外植体有利于诱导出理想的胚性愈伤组织;2,4-D是愈伤组织诱导和继代不可缺少的植物激素,在愈伤组织诱导及继代过程中2,4-D含量以2．0mg／L为宜;AgNO3有利于胚性愈伤组织的诱导和生长,最佳含量为10mg／L,比对照高27．15％．     

玉米成熟胚高效苗再生体系的建立

本研究以6种玉米自交系的成熟胚为外植体,通过优化玉米成熟胚愈伤组织诱导、继代及分化等培养环节,建立了高效的苗再生体系。结果表明,使用切除胚芽和胚根的半胚为外植体,以MS(Murashige&Skoog)培养基作为基础培养基诱导形成的愈伤组织最好,初级愈伤组织率高达80%。在继代培养过程中添加0.5 mg/mL 2,4-D和18mg/mL Dicamba有利于提高胚性愈伤组织诱导率,将胚性愈伤组织诱导率提高到88.89%。添加20 g/L甘露醇可以将褐化率降低到19.44%。分化培养过程中加入2 mg/L Zeatin和6 mg/L TDZ可以将愈伤组织的绿苗分化率提高到48.88%。     

新疆长绒棉胚性悬浮细胞原生质体的培养及再生

在进行新疆长绒棉胚性细胞原生质体培养期间，比较酶液中不同甘露醇浓度，悬浮细胞不同继代时间及不同培养方法，不同包埋培养基，不同滴加液对原生质体培养的影响。发现琼脂糖珠包埋培养最适宜其培养，获得了原生质体的再生，植板率为２９．８４％（以第八天计），进一步培养，获得再生愈伤组织，愈伤是胚性愈伤。