猪流感病毒表位抗原设计与串联表达策略

兽用疫苗的研发,一方面已经从传统减毒的或灭活的病原微生物发展到基因重组疫苗、亚单位疫苗、表位疫苗,从传统的病原学发展到细胞、分子乃核酸水平;另一方面,疫苗的功能已从单一的预防作用发展为预防性疫苗及治疗性疫苗。对疫苗进行设计与优化,已发展成为一门独立的新兴学科。新型疫苗的设计与研制,需要的是庞大的生物信息,如基因组学、蛋白组学、核酸与蛋白相互作用等信息。随着生物信息学的迅猛发展,计算机分析与生物学技术结合得越来越紧密,为生物疫苗设计提供了技术平台。2000年,Hagmann在《Science》上率先提出了“计算机辅助疫苗设…     

猪圆环病毒2型多表位串联体诱导表达及其免疫活性

为了获得体外诱导表达的具有良好免疫原性的PCV2多表位串联体。本试验筛选PCV2主要抗原表位,顺序组成多表位串联体,人工合成其cDNA序列,通过BamHⅠ和SalⅠ定向克隆至原核表达载体pEGX-4T-1多克隆位点,转化BL21感受态细胞,筛选阳性克隆,进行IPTG诱导表达。使用SDS-PAGE对目的基因表达情况进行分析,提取与纯化融合蛋白多肽,Western blot鉴定表达多表位串联蛋白免疫活性。融合蛋白多肽免疫BALB/c小鼠,ELISA测定其抗体,评价其免疫原性。结果显示,成功构建了含7个PCV2抗原表位串联体的表达重组质粒pEGX-4T-1-ep,SDS-PAGE分析显示,融合蛋白多肽在大肠杆菌中获得了有效表达,其分子量约35ku,主要以可溶性形式存在。Western blot结果显示,提取与纯化融合蛋白多肽与PCV2阳性血清具有良好的反应原性。ELISA检测结果显示,纯化的融合蛋白多肽可有效刺激机体产生PCV2特异性抗体,具有良好的免疫原性。结果表明,构建的PCV2多表位串联体表达重组体具有良好的体外表达特性,表达蛋白具有良好的免疫原性。该研究为PCV2表位筛选,功能鉴定及多表位疫苗研究奠定了一定基础。     

猪流行性腹泻病毒纤突蛋白S1抗原表位的串联表达及免疫原性分析

为了获得猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)纤突蛋白S1抗原表位的串联重组蛋白并评价其免疫原性,试验将S1蛋白的抗原表位COE和S1D连接起来组成串联表位S1CD,合成相应的基因片段后克隆至转移载体pFastBac1上,然后转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑和PCR扩增筛选重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-S1CD,再转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,采用间接免疫荧光试验和Western-blot检测方法鉴定重组蛋白S1CD的表达情况。将小鼠随机均分为S1CD蛋白组、PEDV灭活疫苗组和PBS组,分别经背部皮下多点注射重组蛋白S1CD、PEDV HeN170821灭活病毒和PBS与弗氏佐剂等体积混合制成的抗原,检测特异性IgG抗体水平及白细胞介素-4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)含量以评价重组蛋白S1CD的免疫原性。结果表明：重组蛋白S1CD成功在Sf9昆虫细胞中表达,并能与鼠抗His单克隆抗体和PEDV阳性血清发生特异性反应;首次免疫后第28天,S1CD蛋白组的特异性IgG抗体水平极显著高于PBS组(...     

猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白抗原表位区的表达及其免疫原性分析

为研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突蛋白(S)上主要抗原位点的免疫原性,本研究将S基因上A、B、C、D四个位点进行RT-PCR扩增,构建重组质粒pET30a-S,诱导表达后Western-blot检测,表明目的蛋白具有良好的抗原性。将纯化的目的蛋白免疫小鼠3次,在初次免疫后第0,14,28,42天采血,并用间接ELISA方法监测血清抗体动态水平变化。结果表明,获得的重组蛋白能诱导免疫小鼠产生特异性的体液免疫,说明该蛋白具有发展成TGEV亚单位疫苗的潜力。     

猪丹毒杆菌SpaA基因的克隆与生物信息学分析

旨在克隆猪丹毒杆菌表面保护性抗原A(surface protein A,SpaA)的编码基因,并预测该蛋白的二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨猪丹毒杆菌SpaA蛋白在免疫保护中所起的作用.首先对猪丹毒杆菌SpaA基因进行PCR扩增、克隆和测序,并进行同源性比较.应用生物信息学方法,对猪丹毒杆菌SpaA蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测.结果显示,猪丹毒杆菌SpaA基因全长1 881 bp,编码626个氨基酸,发育进化树结果表明分离的2株猪丹毒杆菌菌株与GenBank中其他菌株在进化树中关系较远,自成一个分支.二级结构的预测结果显示该蛋白主要以无规则卷曲、α螺旋和延伸链为主,只有少数的β转角;推测该蛋白有14个B细胞优势抗原表位区域、8个N-肉豆蔻酰化位点.该研究为进一步分析猪丹毒杆菌免疫机理、表位疫苗设计等奠定理论基础.     

猪丹毒杆菌的分离鉴定及其SpaA基因的遗传变异分析

为确定导致福建某猪场猪只发病的病原,从病猪心、肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征、培养特性、生化试验及PCR鉴定,确定为猪丹毒杆菌。SpaA基因测序结果表明该分离菌在第609位点处出现了由胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤,对应的氨基酸是由甲硫氨酸突变为异亮氨酸。致病性试验结果表明,2．1×10^8CFU／mL的菌液10倍稀释后,感染28日龄健康昆明小鼠,该分离菌对28日龄健康小鼠的半数致死量为2．1×10^3.5CFu／mL,死亡小鼠的剖解病变表现为心肌有白色坏死点,肝脏实变、坏死,肺出血和脾脏梗死等,并分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对青霉素、红霉素、氨苄青霉素、强力霉素、先锋霉素、阿奇霉素等较为敏感。     

猪瘟疫苗不同剂量对猪免疫攻毒效果试验报告

本试验根据近年来湖南农村猪瘟疫苗使用头剂量的变化，在室内、室外分别对猪接种不同剂量猪瘟弱毒乳兔苗和牛睾细胞苗，免疫期１０６￣１３０天攻击石门系猪瘟强毒，其室内接种组攻毒结果：猪瘟乳兔苗头剂量０．５ｍｌ１５０个免疫量，保护率１００％（５／５）；头剂量１．０ｍｌ１５０个免疫量保护率１００％（５／５）；头剂量１．０ｍｌ３００个免疫量保护率１００％（４／４）。牛睾国胞苗头剂量０．５ｍｌ３００个免疫量保护率     

猪博卡病毒VP1蛋白抗原表位分析及其克隆表达

为研究猪博卡病毒(PBo V)VP1蛋白在血清学诊断中的作用,用DNAStar软件预测了PBo V NP08株(Gen Bank登录号KR014255.1)VP1蛋白的主要抗原表位,确定1-334个氨基酸为优势抗原表位区,构建重组质粒p ET32a-VP1,将其转化感受态细胞BL21(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为56.7 ku的重组蛋白VP1,主要以包涵体形式存在。纯化后蛋白的Western blot结果表明,表达的VP1蛋白与临床阳性血清具有良好的反应性。用该蛋白包被ELISA板,检测10份临床感染PBo V的猪血清样品和3份未感染猪的血清,结果表明其具有很好的特异性,不与未感染猪的血清发生反应,为建立PBo V感染血清学诊断方法奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白不同表位基因的原核表达及免疫原性分析

纤突蛋白S是猪流行性腹泻病毒(PEDV)表面的重要糖蛋白,S蛋白的S1和S2两个亚基能刺激宿主细胞产生中和抗体,对预防和控制PEDV的感染具有重要意义.本研究根据PEDV基因组S蛋白序列,分别构建pET32a-S1、pET32a-S2及S1和S2的串联重组质粒pET32a-2S,将3个重组质粒分别转染至BL21感受态细...     

新城疫病毒载体表达鸡肾型传染性支气管炎病毒表位疫苗候选株免疫效力评价

对实验室前期构建的新城疫病毒(NDV)载体表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)表位疫苗候选株rLa-IBV-epi进行免疫效力评价。为验证该疫苗候选株的免疫效力,本研究通过免疫3日龄SPF雏鸡,对鸡群抗体水平监测发现,2周后达到顶峰,3周内维持在一个较高的水平。攻毒保护试验表明,rLa-IBV-epi株对试验鸡的IBV攻毒保护率大于90%,对NDV攻毒保护率达100%。本研究为rLa-IBV-epi疫苗候选株的进一步生产使用奠定了基础。     

猪伪狂犬病基因缺失疫苗的制备、安全性、免疫原性、保存期测定及区域试验

为了提供有效的伪狂犬病疫苗,用鸡胚成纤维细胞扩大培养了PrV HB-98突变株（TK^-/gG^-/LacZ^＋）,研制了伪狂犬病基因缺失疫苗,并对该疫苗经肌肉接种、经口等免疫途径的最小免疫剂量进行了测定,同时也对4批疫苗的安全性、效力、免疫期和保存期进行了检测;同时将4批疫苗用于免疫23个猪场的母猪、新生仔猪和育肥猪进行区域试验。测定结果表明,疫苗经上述两种途径接种对不同阶段猪的最小免疫剂量均为10^5.0 TCID50;10倍免疫剂量的疫苗对初生仔猪、15日龄仔猪和妊娠母猪是安全的,免疫猪能抵抗强毒的攻击;疫苗在4℃和-20℃下分别可保存6个月和12个月。对伪狂犬病毒抗体阴性的70日龄商品猪和种猪的免疫期为6个月。田间试验表明,4批猪伪狂犬病基因缺失疫苗安全有效,并可用于仔猪发病时的紧急接种。为猪伪狂犬病基因工程疫苗的制备与应用提供了有力的依据。     

鸭疫里默氏杆菌贵州流行株蜂胶灭活疫苗制备

【目的】制备鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)贵州流行株蜂胶灭活疫苗。【方法】选取RA血清2型贵州流行株(RA-SS-8株)为基础菌株,依次利用分光光度法和平板计数法测定细菌生长曲线,再进行灭活条件筛选,以蜂胶为佐剂制备RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,并进行无菌检验、安全性检验及免疫鸭攻毒保护性试验。【结果】分光光度法测定RA-SS-8株菌液D_{600 nm}值随培养时间变化显示,细菌在0~3 h时增殖缓慢,在3~10 h时增殖趋势明显加快,在10 h以后增殖逐渐趋于平缓,随着培养时间的延长,细菌最终进入衰亡期;平板计数法结果显示,RA-SS-8株D_{600 nm}值为0.1~0.8时,该菌处于对数生长期,且D_{600 nm}值与活菌数呈现良好的线性关系;RA-SS-8株最佳灭活条件为0.2%甲醛溶液、37 ℃灭活12 h;蜂胶灭活疫苗含菌量为3.8×10⁹ CFU/mL,蜂胶干物质含量为10 mg/mL;无菌检验巧克力琼脂培养基上未见菌落生长;安全性检验以2倍免疫剂量接种雏鸭在观察期内未表现出不良反应,大体病变观察未见明显病变;免疫鸭攻毒保护性试验显示,蜂胶灭活疫苗免疫组鸭对RA-SS-8株的攻击后保护率为70%,蜂胶灭活疫苗对试验鸭心脏、肝脏组织均具有良好的保护效果。【结论】本研究成功制备了RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,为蜂胶灭活疫苗制备和动物免疫试验奠定基础。     

仔猪水肿病标准菌株对小鼠和仔猪免疫原性的测定试验

分别以仔猪水肿病标准菌株C83684、C83905、C83527制备的灭活疫苗免疫小鼠和仔猪,14天后分别攻以致死量的强毒菌液及毒素,攻毒试验表明,疫苗免疫效果良好,三株菌株具有良好的免疫原性。     

番鸭细小病毒弱毒株的选育及其生物学特性

应用生物技术对番鸭细小病毒莆田株（ｍｕｓｃｏｖｙｄｕｃｋｌｉｎｇｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ,ＭＰＶ－Ｐ）进行诱变,选育出符合制苗用的弱毒疫苗株（ＭＰＶ－Ｐ１）。该弱毒株失去了对１日龄雏番鸭的致病力,对番鸭胚的ＥＬＤ５０为ｌｇ４．５～ｌｇ５．０;对ＭＤＥＦ细胞ＴＣＩＤ５。为ｌｇ５．０～ｌｇ６．０;在雏番鸭体内连续传５代,未见毒力返强现象。１日龄番鸭免疫接种ＭＰＶ－Ｐ１后,第３天部分鸭血清中出现抗体,第７天全部出现抗体,第２１～３０天抗体效价值达高峰。肌肉注射比滴鼻免疫接种方法效果好。该弱毒株具有良好的免疫原性和遗传稳定性。     

腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因T程疫苗对家兔的免疫试验

将转化C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因表达子粒的工程菌PAK/2pfsC在含羧苄青霉素营养肉汤培养基中培养,用MgCl2法在培养物上清中提取表达产物(纤毛蛋白).将表达的纤毛蛋白产物用弗氏完全佐剂乳化,制成疫苗.用疫苗免疫3只健康家兔,21 d后再次接种;定期采血,用对流免疫电泳和K凝集实验检测试验家兔的体液免疫应答及抗体水平.结果发现,免疫7 d即可产生相应抗体,21 d后抗体效价达到8 000×以上,而且高滴度抗体可维持6个月以上.试验表明,腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因工程疫苗具有较好的免疫应答和免疫原性.     

转基因植物疫苗研究进展

众多研究表明,病毒的抗原决定簇及细菌毒素亚单位均能在转基因植物中成功表达,并保持良好的免疫原性.与现有的疫苗生产体系相比,植物生产疫苗具有安全、经济、稳定、高效等优势.本文概述了利用不同受体植物生产疫苗的研究现状、免疫原性评价及免疫原基因的优化表达策略.     

伪狂犬病基因缺失疫苗株(SA215)生物学特性研究

测定了伪狂犬病gE^-／gI^-／TK^-／LacZ^ 基因缺失疫苗株(SA215)的致细胞病变效应、安全性、免疫原性和接种动物抗体消长规律等生物学特性。试验结果显示，该疫苗株能在Vero细胞上适应生长，并形成典型的蚀斑。其对1日龄仔猪、妊娠母猪、牛、羊以及家兔安全，无不良接种反应，接种动物不向外散毒。SA215疫苗接种猪能抵御高剂量(10’PFU)Fa株强毒感染，攻毒后试验猪的发热期、增重受阻天数、散毒滴度略低于Bartha株疫苗接种猪，低于对照组猪。SA215接种猪能维持长时间的高水平中和抗体滴度。试验结果表明，SA215株是一株安全、免疫原性好的疫苗株。     

新城疫3组基因亚单位疫苗的免疫原性试验

将3个融合表达重组菌pGHN/DE3、pGF/DE3和pGF/E.coli复苏后进行酶切鉴定，确认无误后均经1mmol/L的TPTG诱导，然后分组3次免疫鸡。试验鸡血清经血球凝集抑制试验（HI）和微量细胞中和试验（SN）来检测HI抗体和SN抗体。结果表明：重组菌pGHN/DE3所生产的亚单位苗免疫鸡后，可激发较高的HI抗体，但激发的中和抗体较弱。与I系NDV常规疫苗相比，3个重组大肠杆菌基因工程苗所诱发的中和抗体效价较弱，对各组中起关键作用的中和抗体进行方差分析表明，3个基因工程菌所诱发的中和抗体与常规疫苗免疫组和基础免疫对照相比，差异显著，因此，尽管3种基因工程苗产生了中和抗体，但中和抗体效价上升缓慢，HI抗体效价上升较快。