猪繁殖与呼吸综合征病毒核蛋白单克隆抗体的制备和初步鉴定

克隆了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CC-11株的N基因全序列,将其克隆至原核表达载体pET28a,转化E.coliRosetta株后经0.5 mmol/L IPTG诱导,获得了高水平表达。对表达的N蛋白进行纯化,以50μgN蛋白免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,通过间接ELISA筛选,获得9B12、7C2、7C6共3株稳定分泌抗PRRSV-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,亚型鉴定结果分别为IgG2b、IgG1、IgG1亚型。通过Western blot分析和间接免疫荧光测定表明,3株单抗对PRRSV CC-11株、CH-1R和JXA1-R细胞毒以及4份临床疑似病料均发生特异性反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)的单克隆抗体,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)GP5重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和NS0浆细胞瘤细胞进行融合,经间接ELISA和阻断ELISA筛选、有限稀释法克隆化获得3株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的(mAb)杂交瘤细胞株,命名为4B7、2C5和2E4。间接免疫荧光(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)结果显示,3株mAb均与感染PRRSV BJ 4株的Marc 145细胞特异性反应,表明其可识别天然病毒蛋白。mAb的Ig亚类均为IgG1,细胞培养上清和腹水的ELISA效价分别为1∶256和1∶51 200,Western blot分析表明,mAb均特异性识别PRRSV GP5蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白单克隆抗体制备与鉴定

根据NSP9非结构蛋白参数选取相应30 bp DNA片段,片段串联后人工合成并连接p ET-28a(+)载体,大肠杆菌BL21中表达得到可溶蛋白,镍柱亲和层析纯化后免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞骨髓瘤细胞融合。细胞融合后利用间接ELISA法杂交瘤细胞阳性克隆筛选,2次亚克隆后共获得3株抗PRRSV NSP9单克隆抗体,命名为3B17、3J13、3F19。这3株单抗可与大肠杆菌表达的蛋白产物和PRRSV感染的Marc-145细胞发生特异性反应。在PRRSV感染的Marc-145细胞中,NSP9蛋白表达水平接毒后不断升高,48 h达最高,为深入研究NSP9功能奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP2蛋白的原核表达

根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF2的阳性克隆pTG19-T-GP2。将此基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,经筛选获得了阳性重组质粒pGEX-GP2,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kD的融合蛋白,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难、病毒血症为典型症状的一种传染性疾病,给世界养猪业带来巨大的经济损失。深入研究PRRSV的相关致病机制可为该病防控奠定理论依据。在对PRRSV的研究中,非结构蛋白2(non-structural protein 2, Nsp2)一直是研究的热点,文章综述了Nsp2与遗传变异、病毒致病性、病毒复制、免疫调控和重组疫苗与分子标签等相关的研究进展。Nsp2基因序列在对疫苗毒株的鉴别诊断中发挥重要作用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备与特性分析

【目的】制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体,探讨单克隆抗体临床应用的价值及病毒蛋白的结构和功能。【方法】采用差速和蔗糖不连续密度梯度离心纯化的PRRSV抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞常规融合,经间接ELISA的筛选和有限稀释亚克隆,获得能稳定分泌鼠抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过ELISA、Western blot和免疫荧光试验等方法分析其特性。【结果】成功地获得了3株稳定分泌抗PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为A61、B47和C65。这3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgG1、IgG3和IgG1,均具有ELISA、IFA和Western blot特性,细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别为1×27~1×28和1×105~1×106。特异性测定结果表明,3株单克隆抗体与Marc-145细胞、猪2型圆环病毒和猪细小病毒均无交叉反应。Western blot测定结果表明,3株单克隆抗体均能特异性识别PRRSV-GP5蛋白。【结论】获得了特异性识别PRRSV-GP5蛋白的单克隆抗体,为PRRS免疫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性单克隆抗体的制备与免疫学特性测定

利用重组真核质粒pcDNA3-GP5免疫BALB／c小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到3株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5蛋白的单克隆抗体（McAb）杂交瘤细胞株,分别命名为4C9、5D10、5F12,其中5D10的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价为1：64～1：1024,腹水的效价为1：3200～1：10240,IFA和IPMA的检测结果均为阳性。Western-blot检测证明,这3株McAb均针对PRRSV的GP5蛋白。中和试验表明,5D10和5F12具有病毒中和活性,中和效价分别为1：40和1：80。5D10相对亲和力大于5F12,3株细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体,表明抗GP5蛋白中和性McAb制备成功。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪的一种新传染病，分布广泛且对养猪业造成巨大损失．就猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组结构、基因组编码蛋白、病毒结构蛋白的抗原性等方面的研究进展进行综述，为相关研究提供重要依据．     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸序列设计1对引物,用RT—PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白（N）基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T．1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31（DE3）感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT—PCR扩增,得到一段392bp的片段,与预期结果一致。SDS—PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39．866Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10％的SDS—PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的原核表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M基因序列设计2对引物,通过PCR扩增得到了PRRSV M基因的全长片段和N-末端截短67个氨基酸序列的MNd67基因片段,分别将这些片段插入到表达质粒pET-28a(+)的多克隆位点上构建重组表达质粒,PCR、酶切及测序鉴定表明,成功构建了2种重组表达质粒(pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67)。重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)后利用α-乳糖诱导其表达,SDS-PAGE电泳分析表明,E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV MNd67成功表达分子质量为14ku的重组蛋白,而E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未见明显的表达蛋白。试验结果表明已成功表达截短的PRRSV M蛋白,可为PRRSV诊断抗原和疫苗研究奠定基础。     

高致病性PRRSV NSP 2基因的扩增与分析

利用软件Oligo6.0设计1对针对PRRSV Nsp2基因的特异性引物,对已检测为PRRSV阳性的病料进行PRRSV Nsp2基因扩增及测序.应用DNAstar软件将所测序列与VR-2332毒株、CH-1a毒株(2001)进行比对,发现JXYC与JXNC毒株的核苷酸序列都有87个碱基连续缺失,在与JX2毒株(2007)VR-2332毒株进行比对时发现有相同的缺失,这说明PRRSV已经发生重大变异,而高致病性PRRSV变异不大.该研究补充和丰富了PRRSV毒株的基因组信息数据及PRRSV的分子流行病学的内容.     

PRRSV Nsp2高变区基因的表达及免疫学特性鉴定

本研究分别扩增从"高热病"猪体内分离株(TA-12)及美洲经典株ATTC-VR2332 PRRSV Nsp2基因的高变区,亚克隆至表达载体pET-28a中,转化至E.coli BL21中,在IPTG的诱导下进行表达.用SDS-PAGE、Western-blot对表达产物进行鉴定.表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,对其免疫原性进行研究.建立了以纯化的重组蛋白作为包被抗原的间接ELISA,确定了临界值,用建立的ELISA方法并对400份猪血清进行了检测和应用.结果表明,成功的表达了分离株TA-12及ATTC-VR2332 Nsp2基因的高变区.表达蛋白纯化分别免疫小鼠后,获得多克隆抗体,其抗体效价均为1∶100000.优化的ELISA条件为:包被缓冲液为磷酸盐缓冲液,800 ng/孔,血清样品稀释浓度为1∶100.临界值为0.4.血清检测结果表明以两种蛋白为包被抗原均为阳性的血清最多,占到总数的58.5%,前者阳性后者阴性的血清阳性率28%,前者阴性后者阳性的血清阳性率8.75%,二者均为阴性的占到4.75%.为建立区别两种毒株的鉴别诊断间接ELISA试剂盒奠定基础.     

表达PRRSV 强弱毒Nsp2的Marc 145细胞系的建立及Nsp2蛋白对PRRSV复制的影响

为探讨Nsp2蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的影响,采用体外克隆法构建表达高致病性PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株Nsp2基因的真核表达质粒pEGFP-TJ Nsp2和pEGFP-TJMNsp2,含有增强式绿色荧光蛋白表达盒,瞬时转染重组质粒到Marc-145细胞系单层,利用G418抗性筛选建立细胞系,通过PCR和RT-PCR鉴定。PRRSV感染筛选的细胞系,检测病毒TCID50。结果建立稳定表达TJ株和TJM株Nsp2基因的猴肾细胞系Marc-145-TJ Nsp2和Marc-145-TJM Nsp2;在表达PRRSV TJ株和TJM株Nsp2蛋白的Marc-145细胞上感染PRRSV病毒,在复制早期病毒时增殖速度快,即Nsp2蛋白对PRRSV复制早期有正向调控作用,并且强毒的Nsp2此作用更明显。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒Nsp2基因缺失株Jiangxi-3毒力的进一步研究

通过Reed-Muench法检测从江西发生持续高热的病猪体内分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2基因缺失株Jiangxi-3第9代(Jiangxi-3 F9)的病毒滴度;将此毒株接种于PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原与抗体均为阴性的60日龄健康猪进行猪半数致死量(LD50)的测定,并且对LD50试验中存活下来的试验猪再次进行较大剂量的攻毒试验,另将病毒接种于PRRSV和PCV2抗原和抗体均为阴性的6月龄健康猪,对所有攻毒试验猪通过体温检测、临床症状观察、RT-PCR、ELISA等方法进一步研究Jiangxi-3 F9的毒力.结果表明:Jiangxi-3 F9的病毒滴度为105.25 TCID50·mL-1,Jiangxi-3 F9病毒的LD50为1022·mL-1.动物试验各项检测结果说明Jiangxi-3 F9毒力强.     

莱克多巴胺单克隆抗体的研制

莱克多巴胺(Ractopamine)与戊二酸酐、氯甲酸异丁酯反应后,与牛血清白蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术获得2株稳定分泌抗莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水,间接ELISA方法测定腹水抗体效价为1∶3.2×107。该抗体与克仑特罗交叉反应率为0.3%,体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。获得的单克隆抗体可用于肉品中莱克多巴胺残留检测和莱克多巴胺残留检测试剂盒的开发。     

恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性

将恩诺沙星(ENR)偶联于载体蛋白BSA,形成完全抗原(BSA-ENR)并免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术制备分泌抗恩诺沙星的杂交瘤细胞株,用体内诱生腹水法生产ENR单克隆抗体。结果筛选出4G1-B3,4G1-G1和4G1-B9 3株敏感特异的杂交瘤。3株单抗对ENR的半数抑制浓度(IC50)分别为1.04 ng/mL,2.44 ng/mL,4.24 ng/mL。4G1-B3与环丙沙星有0.02%的交叉反应,与其他竞争物的交叉反应率均小于0.01%;4G1-G1和4G1-B9与其他竞争物的交叉反应率均小于0.01%。     

抗沙丁胺醇单克隆抗体制备与鉴定

[目的]制备特异性抗沙丁胺醇单克隆抗体,为其免疫学检测方法的建立奠定基础。[方法]用SAL-BSA抗原免疫BALB/c小鼠;使用细胞融合技术建立抗SAL的单克隆抗体（SAL mAb）杂交瘤细胞株;体内诱生腹水法制备SAL mAb,并鉴定其免疫学特性。[结果]筛选出2D9和1C4两株杂交瘤细胞,其细胞培养上清效价达1∶104,腹水效价达1∶106;免疫球蛋白亚型鉴定为IgG1;抗体对SAL的半数抑制浓度（IC50）为1.14 ng/ml;与沙丁胺醇和盐酸克伦特罗的交叉反应率（CR）分别为100.00%和26.09%,与其他化合物无交叉反应。[结论]获得了高效价、敏感且异性的抗SAL抗体,为沙丁胺醇残留的免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,获得了3株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1C7A4、4F3F5和4G8F7,其染色体平均数为98～103,间接ELISA检测3株细胞培养上清效价分别为1:3125、1:3125、1:15625,小鼠腹水效价分别为1:390000、1:390000、1:1950000.ELISA结果显示,1C7A4、4F3F5和4G87F仅与融合表达的PCV2-Cap蛋白反应,而与PET-32a载体表达的蛋白不反应.相加ELISA结果显示3株单克隆抗体对应两个不同的病毒抗原位点.间接免疫荧光结果显示,1C7A4、4F3F5和4G8F7能与PCV2发生反应,而不与PCV1发生交叉反应.结果表明所获得的3株单抗是PCV2型特异性的,为PCV1和PCV2鉴别诊断方法的建立奠定了基础.     

温和气单胞菌单克隆抗体的制备及特性分析

利用细胞融合技术建立了5株分泌抗温和气单胞菌CR79-1-1株单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,特异性鉴定获得2株与参考菌株中的温和气单胞菌发生反应,并且与嗜水气单胞菌以及鳗弧菌、爱德华氏菌、克鲁氏耶尔森菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌均不反应的杂交瘤细胞,命名为2G3、1A4;快速酶联免疫分析法测得2G3、1A4的亲和常数为5×108L/mol、1.725×108L/mol;应用方阵配对试验证实,2株单抗针对特异性抗原上不同表位。     

含CpG序列PRRSV SD2 E基因真核表达载体质粒构建及表达

为了提高猪生殖与呼吸综合征病毒山东株(PRRSV SD2株)基因免疫的效果,将PRRSV SD2 E基因插入哺乳动物表达载体PVAX1中,构建出PVAX1-E质粒。再将已筛选出的CpG-ODN序列通过在其两端的粘性酶切末端定向插入含PVAX 1-E的真核表达载体,构建含CpG基因序列真核重组表达质粒CpG-pVAX 1-E。将重组质粒转染COS-7细胞,经RT-PCR检测E基因mRNA的转录和间接免疫荧光试验(IFA)证实:CpG-pVAX 1-E可表达PRRSV GP5蛋白。试验结果为进一步研究PRRSV SD2 ORF5动物免疫反应奠定基础。